高效液相色譜法測定水體中4種苯胺類物質(zhì)

吳翠琴，陳迪云，龔 劍

(1.廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；3.廣東省放射性核素污染控制與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

苯胺類物質(zhì)作為重要的化工原料和中間產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于染料、橡膠、制藥、塑料、農(nóng)藥、油漆等行業(yè)[1]。苯胺類物質(zhì)具有很高的毒性，少量即可中毒，會引起溶血性貧血，導(dǎo)致肝損害造成中毒性肝病，其中一些還有明顯的致癌、致畸、致突變的“三致”作用[2]。中國、美國和歐盟等均將其列入常規(guī)監(jiān)測和優(yōu)先監(jiān)測的污染物名單[3]。由于苯胺及硝基苯胺類物質(zhì)的極性較強(qiáng)，在水中的溶解度較高，易進(jìn)入環(huán)境水體中，因此，建立簡便、靈敏和準(zhǔn)確的方法用于測定水體中的苯胺類物質(zhì)，顯得尤其重要。

液液萃取-高效液相色譜法常用于苯胺類物質(zhì)的測定。胡君梅[4]采用此方法測定了硝基苯胺類物質(zhì)，但是該方法沒有測定檢出限，只是做了線性范圍。在《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第4版)（增補(bǔ)版）中關(guān)于苯胺類物質(zhì)的測定，也是采用液液萃取-高校液相色譜法[5]，但是該方法實(shí)際操作起來存在一些困難。因此，本文對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了更為簡便和靈敏的測定水體中苯胺類物質(zhì)的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器DAD），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，超聲波清洗機(jī)，溶劑過濾器，水性濾膜（0.45μm），針式過濾器（0.45μm）。

苯胺、對硝基苯胺的甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000.0 μg?mL-1），鄰硝基苯胺（純度≥ 99.0%），2, 4-二硝基苯胺（純度≥99.0%），甲醇（色譜純），乙腈（色譜純）。其他試劑均為分析純。

1.2 樣品的處理

水樣用1 mol?L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11~12，取其中100mL放入含有5g氯化鈉（避免乳化現(xiàn)象）的250mL分液漏斗中，振搖，將氯化鈉完全溶解。用8mL二氯甲烷萃取2min，放氣，靜置10min。將萃取后的有機(jī)相用無水硫酸鈉脫水后，收集于雞心瓶，重復(fù)萃取2次，合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至1mL左右，加入2 mL甲醇繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約0.5mL，用甲醇定容至1 mL，用0.45 μm濾膜過濾，待色譜分析。

1.3 色譜的測定條件

色 譜 柱：Agilent Extend-C18，5μm，250mm ×4.6mm；流動相：乙腈和蒸餾水，梯度洗脫條件見表1，流速：1.0 mL?min-1；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

2.1.1 檢測波長及流動相的選擇

苯胺類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中有1個(gè)苯環(huán)，有較強(qiáng)的紫外吸收，可直接用紫外檢測器進(jìn)行檢測?！端蛷U水監(jiān)測分析方法》中，測定苯胺類物質(zhì)時(shí)，采用285 nm作為檢測波長。我們在210~400 nm波長范圍內(nèi)對4種苯胺類物質(zhì)進(jìn)行掃描（圖1），發(fā)現(xiàn)對硝基苯胺和2, 4-二硝基苯胺在285nm幾乎沒有吸收，但在230nm處，4種物質(zhì)都有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，因此本實(shí)驗(yàn)選擇230 nm作為檢測波長。

圖1 苯胺類物質(zhì)的紫外吸收曲線Fig.1 UV absorption curve of anilines

分別考察了2種流動相體系對4種苯胺類物質(zhì)的分離效果：1）甲醇-0.05 mol?L-1乙酸銨-乙酸緩沖溶液；2）乙腈-水溶液。對色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化后，這2種流動相體系都能使4種目標(biāo)物得到很好的分離，但是采用甲醇-0.05mol?L-1乙酸銨-乙酸緩沖溶液體系作為流動相時(shí)，色譜基線不穩(wěn)，且使用緩沖液作為流動相，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，沖洗色譜柱會比較耗時(shí)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水溶液作為流動相。

2.1.2 進(jìn)樣體積

分別考察了3個(gè)進(jìn)樣體積15μL、10μL、5μL，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣為15μL時(shí)會使色譜峰前延。為了達(dá)到更好的靈敏度并獲得對稱性良好的峰形，本實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)樣體積為 10μL。

2.2 樣品的預(yù)處理

2.2.1 萃取溶劑的選擇

苯胺類物質(zhì)是極性較強(qiáng)的化合物，為了能夠有效地萃取水中的苯胺類物質(zhì)，而不把其它極性的物質(zhì)萃取出來，我們以中等極性的乙醚和二氯甲烷作為萃取溶劑進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者對苯胺類物質(zhì)都有較好的萃取效率，但乙醚極易揮發(fā)且有麻醉作用，因此，本實(shí)驗(yàn)采用二氯甲烷作為萃取劑。

2.2.2 靜置時(shí)間的選擇

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用分液漏斗進(jìn)行液液萃取后，分離出有機(jī)相之前的靜置時(shí)間，對苯胺類物質(zhì)的萃取率有影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，可靜置30min以實(shí)現(xiàn)有機(jī)相和水相的完全分離。為此，本實(shí)驗(yàn)分別考察了靜置時(shí)間分別為 5min、10min、15min、30min 時(shí)，苯胺類物質(zhì)的萃取率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜置10min，苯胺類物質(zhì)的萃取率最高，靜置5min時(shí)萃取率偏低，原因可能是有機(jī)相和水相沒有達(dá)到完全的分離。靜置時(shí)間過長（15min、30min），萃取率反而有所降低，可能是苯胺類物質(zhì)的不穩(wěn)定性質(zhì)所致，同時(shí)耗時(shí)較長，因此本實(shí)驗(yàn)選擇靜置時(shí)間為10min。

2.2.3 濃縮方法的選擇

氮?dú)獯蹈珊托D(zhuǎn)蒸發(fā)是濃縮樣品常用的方法。本實(shí)驗(yàn)采用氮吹儀進(jìn)行濃縮，發(fā)現(xiàn)比較耗時(shí)；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，快速且回收率能夠滿足要求，故本實(shí)驗(yàn)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行樣品的濃縮，以提高實(shí)驗(yàn)效率。

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至0.5mL左右，再用甲醇定容至1mL進(jìn)行色譜分析，發(fā)現(xiàn)在2, 4-二硝基苯胺的出峰處出現(xiàn)了一個(gè)很大的包狀峰。考慮到二氯甲烷、甲醇、乙腈極性的差異，嘗試將萃取液濃縮至少量體積后，加入甲醇再繼續(xù)濃縮，發(fā)現(xiàn)包狀峰形消失。最終確定先將萃取液濃縮至1 mL左右，加入2 mL甲醇再繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5 mL，用甲醇定容至1 mL，待色譜分析。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

考察了苯胺類物質(zhì)在0.05~10.00 μg?mL-1濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系，每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，結(jié)果見表2。從表2可知，4種苯胺類物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)r為0.9989~0.9992。以3倍信噪比（S/N）得出方法的檢出限為0.05~0.1 μg?L-1，可以滿足對水體中4種苯胺類物質(zhì)的檢測分析要求。

表2 4種苯胺類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和檢出限Table 2 The standard curve regression equations and detection limits of four anilines

2.4 樣品分析

用棕色瓶從廣州某印染廠采集廢水樣，低溫運(yùn)輸，在24h內(nèi)按上述方法進(jìn)行預(yù)處理后上機(jī)測樣，譜圖見圖2。測得廢水中含有 1.07μg?L-1的苯胺及0.72 μg?L-1的鄰硝基苯胺。

圖2 樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of Sample

2.5 方法的添加回收率和精密度

在印染廢水樣品中添加4種苯胺類物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為10μg?L-1，按照本方法的操作步驟進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，平行操作6次，扣除樣品空白后，計(jì)算回收率和精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，印染廢水中的苯胺類物質(zhì)的平均回收率為85.8%~95.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%~7.2%，說明本方法較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，符合檢測要求。

表3 印染廢水中苯胺類物質(zhì)的回收率和精密度Table 3 Recoveries and their precisions of the anilines spiked in dye waste water (n=6)

3 結(jié)論

本文對水體中的苯胺類物質(zhì)進(jìn)行分析及研究，確定了采用高效液相色譜法測定水體中4種苯胺類物質(zhì)的色譜分析條件和萃取條件。先采用傳統(tǒng)的液-液萃取法，以二氯甲烷為萃取劑萃取水中的苯胺類物質(zhì)，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，再采用反相高效液相色譜法，以乙腈-水為流動相，在230 nm波長處進(jìn)行檢測。苯胺、對硝基苯胺、鄰硝基苯胺和2, 4-二硝基苯胺均實(shí)現(xiàn)了良好的分離。樣品的加標(biāo)回收率為85.8%~95.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%，方法的檢出限為0.05~0.1 μg?L-1，明顯低于《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第4版)（增補(bǔ)版）中苯胺類物質(zhì)的檢出限（0.3~1.3 μg?L-1）。另外，本方法萃取后未經(jīng)硅酸鎂層析柱凈化，也能得到滿意的回收率和理想的色譜圖，說明本方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于水體中苯胺類物質(zhì)的測定。