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    miR-361-3p調控BTG2對HL-60細胞增殖和凋亡的影響*

    2022-12-22 03:16:38許匯娟李珍
    廣東醫(yī)學 2022年11期
    關鍵詞:突變型熒光素酶白血病

    許匯娟, 李珍

    1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科(廣東廣州 510515); 2南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院(廣東廣州 510515)

    急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是髓系造血干/祖細胞惡性疾病,通常以骨髓和外周血中原始和(或)幼稚髓性細胞異常增生為主要特征,大多數(shù)病例病情急重,預后兇險,如不及時治療??晌<吧黐1]。因此,尋找白血病治療靶點,開發(fā)有特異性的靶向藥物具有重要的臨床意義。微小RNA (microRNA,miRNA)是一類大約22個堿基長的非編碼RNA。miRNA通過特異性抑制或降解靶基因的翻譯,調節(jié)靶基因的表達[2]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA參與人體內生理和病理的過程,比如miRNA在細胞分化、新陳代謝以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。在人類癌癥中,miRNA的功能可根據(jù)靶基因的不同,作為調控腫瘤發(fā)生發(fā)展的癌基因或抑癌基因[5]。miR-361被認為是多種腫瘤的致癌因子。研究[6]報道,通過比較14種腫瘤共5727例患者樣本與589例正常人樣本,發(fā)現(xiàn)miR-361在9種腫瘤組織中有高表達。另有研究通過miRNA/mRNA網(wǎng)絡分析表明miR-361與白血病存在密切相關性[7],并且miR-361在急性白血病患者骨髓中也有顯著上調[8]。盡管有很多研究提示miR-361是一種腫瘤因子,在多種惡性腫瘤中有高表達,并且在白血病患者體內表達上調,與白血病密切相關,但是,miR-361-3p 對急性髓系白血病細胞系HL-60細胞增殖的影響,及其靶向分子機制尚鮮見報道。2018年4月至2021年4月,本研究采用了熒光素酶報告基因檢測等技術驗證miR-361-3p和靶基因之間的關系,為闡明miR-361-3p調節(jié)白血病細胞HL-60增殖和凋亡的分子機制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 HEK-293和HL-60細胞購自中國科學院上海細胞庫,T4連接酶、限制性內切酶 XhoⅠ和NotⅠ購自Thermo公司。雙熒光素酶報告基因載體(pmirGLO載體)和LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌DH5α,Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司。DL2000bp Marker,DMEM培養(yǎng)基,Gel Extraction膠回收試劑盒,胎牛血清和Plasmid Mini KitI 質粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司,miR-361-3p和PCR引物購自上海生工生物技術有限公司,雙熒光素酶報告基因熒光檢測試劑盒購自美國Promega公司。CCK-8和細胞凋亡檢測試劑盒購自日本Dojindo公司,GAPDH、二抗:caspase-3、caspase-7、P53、Bcl-2、survive 等抗體均購自美國abcam公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) HEK-293和HL-60細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),加入1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.2.2 靶基因預測 通過靶基因預測數(shù)據(jù)庫starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預測miR-361-3p的靶基因,綜合文獻分析選定與細胞增殖凋亡相關的基因,包括B細胞遷移基因2抗體(B-cell translocation gene 2,BTG2),胞漿多聚元件結合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1,CPEB1)和髓磷脂轉錄因子1(myelin transcription factor,MYT1)作為miR-361-3p的候選靶基因。

    1.2.3 miR-361-3p靶基因熒光報告載體的構建 設計合成BTG2, CPEB1 和MYT1上下游特異性同源引物,如表1。以HL-60細胞cDNA為模板,分別用 BTG2、CPEB1 和MYT1上下游特異性引物擴增BTG2, CPEB1 和MYT1的 3′UTR序列。分別取BTG2, CPEB1 和MYT1基因Polymerase Chain Reaction(PCR)回收產物和psiCHECK-2載體,用XhoⅠ與NotⅠ進行雙酶切。酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,回收純化。按照Plasmid Mini Kit Ⅰ質粒提取試劑盒說明書進行目的片段與載體連接,于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中加入10 μL連接產物,轉化、挑取單菌落擴增,再進行雙酶切、鑒定和測序(上海生物生工有限公司廣州分公司)。

    表1 BTG2、CPEB1 和MYT1引物序列

    1.2.4 HEK-293細胞培養(yǎng)及轉染 將HEK-293細胞接種在24孔板中(8×105·mL-1),培養(yǎng)過夜,用于共轉染試驗。將細胞隨機分組為:野生型+miR-361-3p mimic組、野生型+空質粒組、突變型+miR-361-3p mimic、突變型+空質粒組,每組分別設3個復孔。每孔用無血清培養(yǎng)基稀釋,加入 lipofectamine 2000 2 μL,總體積為125 μL;另取每孔各加入8 μg不同質粒,加入DMEM培養(yǎng)基至總體積125 μL;然后將兩種稀釋液混合,室溫下靜置20 min;每孔加入250 μL轉染復合液,混勻;在 5% CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h,去除含有轉染復合物的培養(yǎng)基后,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

    1.2.5 雙熒光素酶報告基因活性檢測 HEK-293細胞轉染48 h后,去除培養(yǎng)基,用PBS(phosphate buffer saline)清洗2次,每孔加入100 μL的PBL(Passive Lysis Buffer),振搖,收集細胞裂解液。在發(fā)光板中每孔加入20 μL細胞裂解液,100 μL LARⅡ工作液,混勻,檢測熒光素酶活性值;每孔再加入100 μL終止液,檢測熒光素酶活性值,計算前后的比值。

    1.2.6 細胞增殖和凋亡檢測 使用Lipofectamine 2000轉染試劑盒進行轉染,在HL-60細胞中分別轉染miR-361-3p mimics/mimic-NC、miR-361-3pinhibitor/inhibitor-NC或si-BTG2/si-NC后,培養(yǎng)24、48和72 h。然后加入CCK-8(Cell Counting Kit-8),37℃孵育1 h,用酶標儀測定波長450 nm下的吸光度。48 h后,采用流式細胞儀檢測HL-60細胞的凋亡情況。

    1.2.7 實時定量PCR檢測miR-361-3p和BTG2基因表達量 用Trizol法提取各組HL-60細胞中的總RNA,然后根據(jù)逆轉錄試劑盒的使用說明書獲得cDNA。取cDNA和引物,按照實時熒光定量PCR說明書配制反應體系。U6為miR-361-3p的內參,GAPDH為BTG2的內參。采用2-ΔΔCt法計算其相對表達。反應條件為95℃預變性30 s,40個循環(huán)擴增反應(94℃ 30 s,65℃ 30 s,94℃ 30 s),miR-361-3p引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCAGA-3′(正向)、5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCCCAGGTGTGATTCTG-3′(反向),BTG2引物序列為5′-ACGGGAAGGGAACCGACAT-3′(正向)、5′-CAGTGGTGTTTGTAGTGCTCTG-3′(反向),U6引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向),GAPDH引物序列為5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′(正向)、5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′(反向)。

    1.2.8 免疫印跡(Western blotting,WB)檢測蛋白表達 收集各組HL-60細胞進行裂解,提取蛋白,將蛋白溶液和緩沖溶液按 4∶1 的比例混合,煮沸10 min,等到細胞總蛋白樣品。隨后進行上樣、電泳和轉膜,加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗,4℃條件下過夜,TTBS漂洗3次×10 min,加入二抗,室溫封閉 2 h。取出 PVDF 膜,TTBS漂洗,DAB 顯色后照相。

    2 結果

    2.1 重組載體質粒的構建 靶基因以HL-60細胞DNA為模板進行擴增,在200~250 bp左右有 DNA 條帶,與預期的片段大小一致,見圖1-A、1-C和1-E。將雙酶切后的重組質粒進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖1-B、1-D和1-F所示,證實BTG2、CPEB1和MYT1基因3′UTR已擴增出來。雙酶切后野生型質粒和突變型質粒片段大小一致、分子量一致,說明兩種載體構建成功。將篩選出的陽性克隆測序,測序結果進行BLAST比對,結果100%匹配?;駼TG2、CPEB1和MYT1已成功在目的突變區(qū)域實現(xiàn)突變,BTG2、CPEB1和MYT1基因3′UTR突變型部分測序圖如圖1-G、H。

    注:A:BTG2基因 PCR產物電泳圖;B:BTG2基因雙酶切電泳圖;C:CPEB1基因 PCR產物電泳圖;D:CPEB1基因雙酶切電泳圖; E:MYT1基因 PCR產物電泳圖;F:MYT1基因雙酶切電泳圖; G:BTG2基因3′UTR突變型部分測序圖;H:CPEB1基因3′UTR突變型部分測序圖;I:MYT1基因3′UTR突變型部分測序圖

    2.2 雙熒光素報告基因系統(tǒng)分析miR-361-3p與靶基因的作用關系 通過Starbase檢索發(fā)現(xiàn),BTG2、CPEB1和MYT1 3′UTR與miR-361-3p存在結合位點。如表2所示,與 NC對照組相比,共轉染突變型BTG2 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與此相反,共轉染野生型BTG2 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)。另外,與NC對照組相比,共轉染突變型CPEB1和MYT1 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);共轉染野生型CPEB1和MYT1 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表2 熒光酶活性

    2.3 miR-361-3p/BTG2軸調控HL-60細胞增殖和凋亡 與NC對照組相比,在HL-60細胞中轉染miR-361-3pmimic后,細胞中miR-361-3p的表達水平顯著升高(P<0.01);在HL-60細胞中轉染miR-361-3pinhibitor,細胞中miR-361-3p的表達水平顯著降低(P<0.01),見表3。并且,在HL-60細胞中轉染miR-361-3pmimic,細胞中BTG2的表達水平顯著降低,反之,在HL-60細胞中轉染miR-361-3pinhibitor,細胞中BTG2的表達水平顯著升高(P<0.01),見表4。CCK-8實驗結果表明,miR-361-3p mimics能促進細胞增殖,與NC對照組相比,24、48和72 h的細胞增殖明顯(P<0.01);與此相反,miR-361-3p inhibitor可抑制細胞增殖。同時,沉默BTG2也能促進HL-60細胞增殖(表4)。流式細胞術結果顯示(表4和圖2),與NC對照組相比,miR-361-3p mimic組和si BTG2組HL-60細胞凋亡比值下降,而miR-361-3p inhibitor組,細胞凋亡比值顯著升高了(P<0.01)。

    圖2 流式細胞術檢測各組HL-60細胞中細胞凋亡圖

    表3 各組HL-60細胞中miR-361-3p表達水平

    表4 各組HL-60細胞中BTG2 mRNA表達水平、細胞增殖和細胞凋亡值

    2.4 miR-361-3p/BTG2軸調控P53信號通路 與NC對照組相比,沉默BTG2后,HL-60細胞中P53、促凋亡因子caspase3/7蛋白表達水平均顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。反之,凋亡抑制因子Bcl-2、survive的蛋白表達水平顯著上調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3和表5。

    表5 各組HL-60細胞中caspase-3、caspase-7、P53、Bcl-2和survivine蛋白表達水平

    圖3 Western blot 檢測HL-60細胞中caspase 3、caspase 7、p53、Bcl2和survivine蛋白的表達

    3 討論

    MiRNA是指一大類負調控基因表達的非編碼蛋白質的小RNA。它們在許多生物功能中起著至關重要的作用,如細胞生長、增殖、分化和凋亡[2-3]。人類多種惡性腫瘤(包括AML)的發(fā)生和發(fā)展與miRNAs的表達異常密切相關。一個miRNA能夠靶向調控多個靶基因,從而發(fā)揮多種生物學功能。miR-361-3p在多種惡行腫瘤中表達顯著性上調,起著癌基因的作用。2013年,Du等[9]首次報道了miR-361-3p是一種新的促癌基因。之后,相繼有研究表明,miR-361-3p可調節(jié)人肺腫瘤細胞、前列腺癌細胞和口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的增殖和遷移[10]。例如,miR-361-3p通過負調控雙特異性磷酸酶2(DUSP2)促進EMT,激活胰腺癌細胞中的ERK信號,從而促進細胞增殖[11]。這項研究還提供了臨床證據(jù),表明高水平的miR-361-3p與腫瘤晚期和較短的存活率有關。miR-361在新診斷的 AML 患者的血漿中顯著增加(與健康對照組相比),經化療后顯著降低[12]。因此,我們推測miR-361-3p可能是一種AML 潛在的治療靶點,它的靶向分子機制尚需進一步研究。為了探究miR-361-3p的靶基因,本研究通過生物信息學軟件預測和相關文獻分析,選取增殖凋亡相關的3個基因。進一步通過靶基因的3′UTR克隆至雙熒光酶報告基因載體上,然后將構建成功的報告基因與miR-361-3p mimics 共轉染HEK-293細胞中,雙熒光素酶活性檢測結果顯示,miR-361-3p與BTG2有直接的靶向作用關系。

    BTG2是BTG/TOB基因家族中第一個識別的基因,屬于抗增殖基因家族[13]。BTG2通過幾個重要的信號通路調節(jié)細胞生長、死亡、遷移、凋亡。同時,大量文獻報道了在多種不同類型的癌細胞中存在BTG2 基因表達水平降低甚至缺失,與之相反,在其相應的正常細胞中 BTG2 基因表達水平明顯較高,由此推測BTG2基因的表達異常與腫瘤具有密切關系,這提示了腫瘤的形成可能與 BTG2 基因表達相關[13-14]。在淋巴血液惡性腫瘤中,也發(fā)現(xiàn)存在BTG1/BTG2基因的缺失[15]。多項研究報道了,在HL-60細胞中,BTG2的高水平表達與抑制細胞增殖,促進細胞凋亡和分化相關[16-17]。為了探究miR-361-3p對白血病細胞增長的影響是否由BTG2介導,我們用miR-361-3p mimics/inhibitor或si-BTG2轉染HL-60細胞后進行細胞增殖或凋亡的檢測,結果證實了miR-361-3p/BTG2軸可調控白血病細胞的增殖和凋亡。

    P53通路是重要的抑癌信號通路,它可通過調節(jié)細胞周期進程和(或)細胞凋亡等發(fā)揮抑癌作用[18]。我們進一步在蛋白水平驗證沉默BTG2是否影響P53及其下游相關因子的表達。研究結果提示了miR-361-3p/BTG2軸在白血病HL-60細胞中可調控P53信號通路。綜上所述,miR-361-3p通過BTG2調控P53通路影響白血病細胞的增殖和凋亡。這進一步為miR-361-3p/BTG2作為潛在的靶點被用于臨床AML的診斷和治療,提供更多的研究資料和實驗依據(jù)。

    利益相關聲明:論文的全部作者聲明,在課題研究和論文撰寫過程中不存在利益沖突。

    作者貢獻說明:實驗設計及論文撰寫由李珍完成;實驗實施,數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計及論文撰寫由許匯娟完成。

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