貴州旱稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性評價及抗源利用潛力分析

何海永，遲煥星，薛 原，譚清群，陳惠查，陳 文，陳小均，趙玳琳，李繼業(yè)，楊學輝

(1.貴州省植物保護研究所，貴陽 550006；2.貴州省煙草公司安順市公司，貴州 安順 561000；3.貴州省農(nóng)作物品種資源研究所，貴陽 550006；4.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，貴陽 551400)

稻瘟病是水稻最重要的病害之一，嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，一般減產(chǎn)10%～20%，嚴重可達40%～50%，甚至顆粒無收[1-2]。實踐證明，培育和利用抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的措施，然而由于稻瘟病菌生理小種致病力變異頻率高，抗性品種尤其帶有單一抗性基因的品種會隨著種植年限的增加而抗性減弱或喪失[3]，因此，在水稻與稻瘟病菌的“軍備競賽”過程中[4]，只有不斷加強稻種資源抗稻瘟病鑒定與評價，才能為抗瘟新基因的挖掘以及培育持久廣譜抗病新品種提供新抗源。

稻種資源是保障國家糧食安全的戰(zhàn)略性資源，其保護、評價以及創(chuàng)新利用受到世界各國的高度重視[5-6]。近年來，眾多學者通過人工接種或自然誘發(fā)進行稻瘟病抗性鑒定，發(fā)掘了一大批新抗源。潘大建等[7]在水稻苗期采用人工接種稻瘟病菌混合菌株的方法，對廣東高州108份普通野生稻進行了稻瘟病抗性鑒定，篩選出2份中抗材料；陳燦等[8]對廣西13個地區(qū)的1 786份野生稻進行了苗期和成株期稻瘟病綜合抗性鑒定評價，從普通野生稻和藥用野生稻中分別鑒定出9份和4份兼抗葉瘟穗頸瘟的材料；徐志健等[9]利用廣西7個優(yōu)勢稻瘟病菌生理小種對419份廣西水稻地方品種核心種質(zhì)進行苗期噴霧接種抗性鑒定，獲得抗譜在80%以上的高抗品種14個；朱業(yè)寶等[10]對國外引進的156份水稻種質(zhì)資源進行了連續(xù)2年的田間自然抗性鑒定，并對8個稻瘟病抗性基因進行了分子檢測，綜合篩選出8份抗性較好的抗源；李丹婷等[11]對300份東南亞引種資源進行成株期人工注射接種抗性鑒定，從中篩選出9份優(yōu)質(zhì)抗源；張文龍等[12]對51份云南地方水稻品種進行了稻瘟病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)品種冷水谷、粘鈺香、毫糯洪、海濱糯、思茅糯在田間與室內(nèi)都表現(xiàn)為高抗；楊楠等[13]利用8個稻瘟病菌菌株對云南地方秈粳稻資源品種各23份進行苗期噴霧接種鑒定，結(jié)合田間自然抗性鑒定篩選出鐮刀谷(粳稻)、香糯(秈稻)、毫糯早(秈稻)和老品種糯谷(秈稻)等5份高抗品種；徐建欣等[14]利用云南稻瘟病菌4個優(yōu)勢小種對30份云南地方陸稻進行稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果2份品種表現(xiàn)為高抗，7份表現(xiàn)為抗；鄢小青等[15]對60份收集和引進的水稻核心種質(zhì)進行田間自然誘發(fā)鑒定，發(fā)現(xiàn)大部分材料抗穗瘟表現(xiàn)良好；夏小東等[16]從203份中國稻種資源初級核心種質(zhì)中篩選出須谷糯、貴朝2號等抗不同生理小種的優(yōu)異抗源供育種利用。以上研究表明，我國野生稻、地方稻種以及部分外引資源中不乏高抗稻瘟病的優(yōu)質(zhì)水稻資源，但對我國豐富的旱稻種質(zhì)資源的稻瘟病抗性研究卻相對較少。

旱稻又稱為陸稻，有極強的抗旱能力，蘊含抗旱、耐瘠和抗逆等優(yōu)異基因[17]，但目前通過省級以上審定的旱稻品種中，稻瘟病中等抗性及以上的品種僅有3個，分別為旱優(yōu)8號、早優(yōu)681和節(jié)優(yōu)804[18-20]。因此，開展旱稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性鑒定評價，加快選育優(yōu)質(zhì)抗瘟新品種，對我國發(fā)展旱稻生產(chǎn)，保障糧食安全具有重要意義。我國從20世紀30年代初至80年代初，完成了2次地方稻種資源的考察和收集工作，獲得了大量的地方旱稻品種，截至2003年，入國家長期庫保存的旱稻有3 908份，占地方稻種資源(49 348份)的7.92%[21]。而云南、貴州和廣西三省旱稻資源占全國的70%，其中又以貴州冊亨縣最多[22]?！捌呶濉?、“八五”期間，貴州陸續(xù)開展了稻種資源稻瘟病抗性鑒定與篩選研究，其中就包括貴州省農(nóng)科院水稻所資源庫中收集保存的部分旱稻資源，但未對其稻瘟病抗性進行系統(tǒng)鑒定評價。鑒于水稻生產(chǎn)中稻瘟病的威脅日益嚴重以及目前抗旱育種中缺乏對旱稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性的評價，本研究選取近兩年從貴州各地分離鑒定的稻瘟病菌主要生理小種，對源自基因庫的246份旱稻種質(zhì)資源和實地收集的20份旱稻地方品種進行稻瘟病抗性鑒定評價，并對篩選出的旱稻抗源主要農(nóng)藝性狀進行系統(tǒng)分析評價，以期為旱稻種質(zhì)資源的改造利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

266份試驗材料來自于貴州省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源庫和收集的地方品種，其中資源庫246份，地方品種20份；其中黔東南州22份、黔南州32份、黔西南州159份、銅仁地區(qū)5份、六盤水市5份、安順地區(qū)30份、貴陽市8份、遵義地區(qū)2份、畢節(jié)地區(qū)2份以及地區(qū)來源不明的1份。所取材料按照35%的比例從資源庫中抽取，基本反映了貴州省內(nèi)各地區(qū)(市)擁有的旱稻種質(zhì)資源數(shù)量。材料分為秈型旱稻和粳型旱稻，其中秈型材料116份，粳型材料148份，另外2份不明確。

鑒定用稻瘟病菌菌株來源于貴州各水稻主產(chǎn)區(qū)，分屬A1、B1、B15、C1、D1、E1、G1等6個種群15個生理小種。

1.2 稻瘟病抗性鑒定

1.2.1人工接種鑒定

試驗在貴州省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所大棚進行，采用人工接種方法誘發(fā)苗瘟、穗瘟，接種方法及病情評價標準參照《農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范—第1部分：水稻抗稻瘟病》[23]執(zhí)行。在稻苗3～4葉期和始穗期，以濃度約為2×105個/mL稻瘟病菌孢子的混合懸浮液作為接種體，分別采用苗期噴霧和穗期注射接種方法進行苗期及成株期抗性鑒定，以特特勃和麗江新團黑谷作為抗病和感病對照。

1.2.2自然病圃鑒定

對苗瘟、穗瘟綜合抗性表現(xiàn)中抗以上的旱稻材料進行自然病圃鑒定。病圃設(shè)在貴州省湄潭縣興隆鎮(zhèn)料塘村，海拔780 m，常年空氣濕度較大，晨霧露大，是稻瘟病常發(fā)區(qū)之一。每份材料5行、每行6叢，每叢2～4株基本苗，株行距為13.3 cm×20 cm，供試品種兩側(cè)各種1行感病品種大粒香，重施基肥。

1.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

農(nóng)藝性狀調(diào)查在貴州省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所進行。采取隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復，每份材料種3行，每行15株，單株栽插，栽培規(guī)格為25 cm×16.5 cm，肥水管理按當?shù)爻Ｒ?guī)進行。調(diào)查每份材料的生育期(GD)、株高(PH)、穗長(PL)、單株有效穗(PP)、穗粒數(shù)(SP)、結(jié)實率(MR)、千粒重(WG)和單株產(chǎn)量(YP)等8個主要農(nóng)藝性狀。農(nóng)藝性狀調(diào)查及考種標準見文獻[24]、文獻[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)合苗瘟、穗瘟計算抗性指數(shù)并進行綜合抗性評價，抗性指數(shù)(RI)=(葉瘟平均病級×25%+穗頸瘟病穗率平均病級×25%+穗瘟損失指數(shù)病級×50%)，0級(高抗HR)：RI<0.1，1級(抗R)：RI≤2，3級(中抗MR)：2.1≤RI≤4，5級(中感MS)：4.1≤RI≤6，7級(感S)：6.1≤RI≤7.5，9級(高感HS)：RI≥7.6。

根據(jù)人工接種抗性鑒定的綜合抗性指數(shù)與自然病圃鑒定的抗性指數(shù)計算平均綜合抗性指數(shù)，并對平均綜合抗性指數(shù)分級評價供試材料對稻瘟病的綜合抗性。

使用 Microsoft Excel 2019軟件對農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進行處理并計算平均值和標準差，再利用SPASS 22.0軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱稻稻瘟病人工接種抗性鑒定評價

苗期和成株期人工接種抗性鑒定綜合結(jié)果(圖1)表明，266份旱稻中表現(xiàn)高感的有156份、感病38份、中感34份、中抗26份和抗病12份，無高抗材料，分別占鑒定總數(shù)的58.65%、14.29%、12.78%、9.77%和4.51%。所有高感材料均來自種質(zhì)庫，其余種質(zhì)庫材料中有36份感、31份中感、18份中抗、5份抗，分別占鑒定材料的13.53%、11.65%、6.77%、和1.88%；收集資源材料中1份感、4份中感、8份中抗和7份抗，分別占鑒定材料的0.38%、1.50%、3.01%和2.63%。共計篩選出38份稻瘟病綜合抗性表現(xiàn)為中抗及以上的材料，其中23份為種質(zhì)庫資源，占8.64%，15份為收集材料，占5.64%；38份抗源中粳型旱稻占33份，秈型旱稻占5份；絕大部分材料苗瘟和穗瘟抗性表現(xiàn)一致，個別材料有差異，如GUR 005(紅旱糯稻)苗期表現(xiàn)為高抗，但穗瘟則表現(xiàn)為高感，而GUR 072(旱谷)則與之相反?？傮w上，收集材料對稻瘟病的抗性表現(xiàn)較好，抗病種質(zhì)占比較高。

圖1 266份旱稻稻瘟病人工接種抗性鑒定與評價Fig.1 The blast resistant identification and evaluation of 266 upland rice varieties by artificial inoculation

表1 38份旱稻抗源稻瘟病自然病圃鑒定與評價Table 1 The blast resistant identification and evaluation of 38 upland rice resistant resources in the field nursery

2.2 38份抗源稻瘟病自然病圃鑒定與抗性綜合評價

2.2.138份抗源稻瘟病自然病圃鑒定分析

在266份旱稻材料人工接種稻瘟病抗性評價中，發(fā)現(xiàn)38份材料綜合抗性表現(xiàn)較好，均在中抗及以上。為進一步評價這些材料在自然栽種條件下對稻瘟病的抗性水平，選擇貴州省稻瘟病常發(fā)、重發(fā)區(qū)湄潭縣興隆鎮(zhèn)(國家水稻稻瘟病抗性區(qū)試鑒定點)種植以上抗源材料，對其進行自然病圃抗性鑒定評價。結(jié)果(表1)表明，所有材料苗瘟相對較輕，僅GUR 057為7級，其他均在7級以下；穗瘟比苗瘟重，病穗率分級為7級及以上的材料有24份，占鑒定材料的63.16%，損失指數(shù)分級達7級及以上的材料有22份，占鑒定材料的57.89%；對比發(fā)現(xiàn)，部分材料病穗率高，但損失指數(shù)較低，如GUR 192、GUR 194；通過抗性指數(shù)對供試抗源稻瘟病自然病圃抗性進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)對稻瘟病表現(xiàn)為高感的有8份，感病8份，中感17份，中感及以上材料占比為86.84%，GUR 194(白殼山谷)、GUR 257(旱谷(4))和GUR 259(旱谷(6))表現(xiàn)為中抗，GUR 153(旱糯)和GUR 258(旱谷(5))表現(xiàn)為抗病。與人工接種抗性鑒定綜合評價結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)人工接種為抗的材料自然病圃鑒定結(jié)果不一定為抗，兩者不具有一致性，因此任意單獨的結(jié)果都不能體現(xiàn)供試材料的真實抗性水平。

表2 38份旱稻抗源稻瘟病抗性綜合評價Table 2 The blast comprehensive evaluation of 38 upland rice resistant resources

2.2.238份抗源稻瘟病抗性綜合評價

對人工接種鑒定初篩出的38份抗源，結(jié)合其自然病圃鑒定結(jié)果進行稻瘟病抗性綜合評價，結(jié)果(表2)表明，通過人工接種和自然病圃篩選后，GUR 011(旱高糯)、GUR 033(旱香糯)等13份材料對稻瘟病表現(xiàn)出較好的抗性，其中3份為抗、10份為中抗，無高抗抗源。13份抗源中，收集材料有7份，占53.85%，種質(zhì)庫抗源6份，占供試材料的2.26%，占種質(zhì)庫材料的2.44%，相比而言，收集材料的抗性比率較高，無論人工接種還是自然病圃鑒定都表現(xiàn)出較好的抗性?？梢姡?jīng)過長期的自然選擇，這些仍在當?shù)胤N植的旱稻材料對稻瘟病保持了較好的自然抗性，可以作為抗病品種選育或抗性改良的優(yōu)異抗源。

2.3 38份抗源材料8個主要農(nóng)藝性狀的聚類分析

以標準化變量的歐氏距離作為統(tǒng)計量，采用離差平方和法對供試抗源的8個主要農(nóng)藝性狀進行聚類分析，結(jié)果(圖2)顯示，當遺傳距離為13.68時，表型性狀可分為兩個大類，其中第一類有21份，第二類又可分為2個亞類，分別有15份和2份。第一類生育期相對較長，植株較高，有效分蘗相對較少，穗型偏大，平均結(jié)實率81.9%，千粒重和單株產(chǎn)量偏低，該類群旱稻種質(zhì)具有大穗多粒、少分蘗、植株高大等特點(表3)；第二類中的第一亞類屬中穗大粒型，具高結(jié)實率，平均結(jié)實率84.9%，同時具有較多的有效分蘗，用于品種選育的產(chǎn)量潛力較大。第二類的另一亞類只有2份種質(zhì)，中等穗型穗粒數(shù)、結(jié)實率和單株產(chǎn)量均偏低，作為育種用抗源難以兼顧產(chǎn)量因子。

38份抗源中，綜合人工接種和自然病圃鑒定，抗性表現(xiàn)較好的只有13份，其與產(chǎn)量相關(guān)的主要性狀見表4。13份抗源的主要農(nóng)藝性狀有一定差異，變幅分別為：生育期136～169 d，株高139.0～174.7 cm，單株有效穗4.6～9.6穗，穗長18.6～33.7 cm，穗粒數(shù)99.4～254粒，結(jié)實率56.7%～92.3%，千粒重21.3～36.27 g，單株產(chǎn)量13.5～34.2 g。說明貴州旱稻抗稻瘟病種質(zhì)資源在抗性和產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀上具有豐富的遺傳多樣性，不乏結(jié)實率高(GUR 011、GUR 258)、大穗大粒(GUR 105、GUR 194)、分蘗力強(GUR 194、GUR 259)和單株產(chǎn)量達30 g以上(GUR 033、GUR 171)的旱稻抗病種質(zhì)，在進行抗病育種時，可根據(jù)目標選擇相應的抗源進行品種改良或選育中間材料使用。

圖2 38份旱稻抗源聚類分析Fig.2 The cluster analysis of 38 upland rice resistant resources

3 討 論

稻瘟病是威脅世界稻米生產(chǎn)的最主要病害，實踐證明，選育和種植抗病品種是控制該病最根本有效的措施，而抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘、研究與利用又是水稻抗稻瘟病育種的重要基礎(chǔ)[26-27]。對此，世界各產(chǎn)稻國均利用本國或引進的抗源開展抗瘟育種，并取得了豐碩的成果[28]。我國自20世紀70年代先后開展了5次規(guī)模較大的聯(lián)合鑒定或協(xié)作攻關(guān)，分別對22萬余份的稻種資源進行了包括稻瘟病在內(nèi)的抗病蟲鑒定，篩選出一批在多個稻區(qū)表現(xiàn)抗病且抗瘟性穩(wěn)定的抗源材料[29-31]。其中，來自云南的抗源材料包含眾多的旱稻種質(zhì)，在篩選出的廣譜抗性品種中，粳型旱稻的抗性高于秈型旱稻以及粳型水稻[32]。本研究首先通過人工接種對266份貴州山區(qū)特有農(nóng)業(yè)生態(tài)條件下形成的旱稻種質(zhì)資源進行稻瘟病抗性鑒定評價，篩選出的38份抗源中粳型旱稻占33份，秈型旱稻占5份，粳型旱稻稻瘟病抗性高于秈型旱稻。這與云南稻種資源抗病蟲性鑒定協(xié)作組[32]以及徐建欣等[14]的研究結(jié)果一致，但楊楠等[13]對云南地方秈粳水稻的稻瘟病抗性研究表明，秈稻的抗性整體高于粳稻。由此說明，旱稻和水稻種質(zhì)資源的秈粳類型與稻瘟病抗性間的關(guān)系較復雜，可能受遺傳進化、品種地理來源、稻瘟病菌生理小種組成等影響。另外，13份綜合抗性表現(xiàn)為中抗及以上的材料中，有53.85%的材料為收集品種，可見經(jīng)過長期的自然選擇，這些仍在當?shù)胤N植的旱稻材料與稻瘟病菌共同進化，對稻瘟病產(chǎn)生了較好的自然抗性，可以作為抗病品種選育或抗性改良的優(yōu)異抗源。部分旱稻材料如GUR 194等，穗瘟發(fā)病率較高，但其產(chǎn)量損失率卻較低，說明病害嚴重度較低，表現(xiàn)出水平抗性的特點，是針對性選育廣譜抗瘟品種的極佳抗源。

客觀準確評價稻種資源的抗病性，是開展抗病機理研究及抗病育種的關(guān)鍵基礎(chǔ)。生產(chǎn)中，影響水稻產(chǎn)量損失嚴重的主要是穗頸瘟，苗葉瘟與穗頸瘟的發(fā)生受氣候等諸多因素的影響相關(guān)性并不明顯[33]，因此，貴州省抗稻瘟病性人工接種鑒定均是結(jié)合苗期噴霧接種和成株期穗苞注射接種進行。基于此，本研究先通過人工接種鑒定淘汰大部分材料，再通過自然病圃誘發(fā)復鑒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人工接種抗性表現(xiàn)較好的38份材料自然誘發(fā)復鑒表現(xiàn)較差，僅有GUR 153、GUR 194等5份材料表現(xiàn)為中抗或抗，大部分材料的抗性表現(xiàn)為中感、感或高感，這說明自然病圃鑒定點稻瘟病菌致病種群可能發(fā)生了變化。由于湄潭自然病圃每年種植的是來源不同的水稻材料，且大部分為秈稻，再加上每年的氣候變化，稻瘟病菌生理小種受品種和環(huán)境的影響可能與往年采集分離的優(yōu)勢小種致病力不同，導致田間與人工接種的抗性有較大差異。這也進一步說明通過苗期和成株期人工接種鑒定結(jié)合自然病圃鑒定的嚴格篩選，選出的材料其抗性是真實可靠的。目前，旱稻抗性品種十分匱乏[18]，后續(xù)應進一步對本研究篩選出的抗源材料進行抗病基因型分析，以期發(fā)現(xiàn)新的抗病基因，為旱稻抗病育種提供新材料，

優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗一直是水稻育種的總體目標[34]，在發(fā)掘現(xiàn)有抗源材料的基礎(chǔ)上，若對其中具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的材料開展評價、利用和改造方面的研究，就可為育種部門提供科學依據(jù)[29]。本研究表明，貴州旱稻種質(zhì)資源中的抗瘟材料，其與產(chǎn)量相關(guān)的主要農(nóng)藝性狀彼此間差異較大，其中，單株有效穗數(shù)2.8～11.2穗，穗長18.6～34.3 cm，穗粒數(shù)99.4～282粒，結(jié)實率28.6%～96.3%，千粒重22.1～36.5 g，單株產(chǎn)量10.4～36.4 g，可見這些旱稻抗源與產(chǎn)量相關(guān)的主要農(nóng)藝性狀具有豐富的遺傳多樣性。對比國內(nèi)外近年選育的高產(chǎn)優(yōu)異旱稻品種(品系)[35-38]的主要農(nóng)藝特性可知，貴州省旱稻種質(zhì)資源中不乏結(jié)實率高、大穗大粒、分蘗力強的抗源材料，綜合產(chǎn)量性狀較高(單株產(chǎn)量>30 g)的就達15份，挖掘這些抗源對抗旱品種選育具有重要意義。

表3 38份旱稻抗源的聚類分析Table 3 Cluster analysis of 38 upland rice resistant resouces

表4 13份旱稻抗源與產(chǎn)量相關(guān)的主要農(nóng)藝性狀Table 4 Agronomic traits related to yield of 13 upland rice resistant resources

4 結(jié) 論

本研究首先采用苗期、成株期人工接種稻瘟病菌的方法對266份貴州地方旱稻種質(zhì)資源進行稻瘟病抗性評價，篩選出38份抗性表現(xiàn)為中抗及以上的抗源。進一步通過自然病譜鑒定，綜合人工鑒定結(jié)果篩選出GUR 011(旱高糯)、GUR 033(旱香糯)等13份抗源材料，其中收集材料占53.85%。聚類分析發(fā)現(xiàn)，38份抗源材料的8個主要農(nóng)藝性狀分為兩大類，其中第二大類的第一亞類屬中穗大粒型，平均結(jié)實率84.9%，有效分蘗多。綜合稻瘟病抗性和農(nóng)藝性狀特點，篩選出結(jié)實率高(GUR 011、GUR 258)、大穗大粒(GUR 105、GUR 194)、分蘗力強(GUR 194、GUR 259)和單株產(chǎn)量達30 g以上(GUR 033、GUR 171)的旱稻抗病種質(zhì)8份供育種利用。