豆類活性肽PA1b研究進展

黃欣媛，范紅波

(1.湖北工程學院 湖北省植物功能成分利用工程技術研究中心，湖北 孝感 432000；2.湖北職業(yè)技術學院 醫(yī)學基礎部，湖北 孝感 432000)

提取自豌豆種子中的小分子多肽PA1b(Pea Albumin 1 Subunit b，豌豆白蛋白1b)[1]具有顯著的昆蟲毒性，能殺滅一些蚜蟲和糧食儲藏中的主要害蟲象鼻蟲，很有希望開發(fā)成新型生物殺蟲劑。PA1b在其他豆科植物中也廣泛分布，均具有高度緊縮的三維結構，構象非常穩(wěn)定，不被殺菌劑變性，也耐受胃酸降解，是目前已知的少數(shù)幾種口服活性的昆蟲毒性肽之一。此外，PA1b還表現(xiàn)出激素樣生理活性，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，在哺乳動物中還能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，是一種重要的多功能生物活性肽。

1 PA1b的結構及其生物多樣性

1.1 PA1b的結構

PA1b由37個氨基酸殘基組成，分子內(nèi)第3、7、15、20、22和32位均為半胱氨酸，形成三對二硫鍵(圖1)。這些二硫鍵的三維排布是典型的抑制胱氨酸結(cystine knot inhibitor, ICK)結構模型(圖2)，這一結構賦予PA1b高度的穩(wěn)定性，在煮沸、有機溶劑(如：甲醇、戊烷、乙醚乙酸酯、丙酮、15%三氯乙酸水溶液等)提取后仍有活性，可以耐受蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K)、昆蟲腸道提取物或反芻動物瘤胃的消化降解作用[2-5]，也使得PA1b的分離純化程序相對簡單，可以從豌豆粉中經(jīng)溶劑萃取和經(jīng)典反相HPLC完成[6]。

圖1 PA1基因的結構和PA1b的一級結構

圖2 PA1b的三維結構

1.2 PA1b的編碼基因——PA1基因

在豌豆中，PA1b由PA1(pea albumin 1)基因編碼[1]。PA1具有兩個外顯子，由一段位于信號肽編碼序列內(nèi)的較短的內(nèi)含子分隔開(圖1)。PA1基因最初轉錄和翻譯為前原蛋白PA1(130aa，分子量13.9kDa)，通過信號肽(26aa，2.7kDa)靶向運送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。信號肽裂解后產(chǎn)生的原蛋白(104aa，11.2kDa)再被引導至豌豆種子蛋白質(zhì)儲存體中進行內(nèi)源性蛋白裂解，切除兩個前肽片段后最終產(chǎn)生兩個成熟形式的多肽，即PA1a(53aa，6kDa)和PA1b(37aa，3.8kDa)。

PA1基因在豌豆種子早期萌發(fā)中很少或不轉錄，但在豌豆生長發(fā)育成熟過程中轉錄水平逐漸增加達到最大值(開花后20 ～ 22天)，然后急劇下降[1,4]。窄葉羽扇豆中的PA1b樣基因也主要在萌發(fā)的種子中存在，種子發(fā)芽兩天后就檢測不到[7]，這些研究表明PA1基因的表達在豆科種子萌發(fā)和生長過程中具有嚴謹?shù)臅r空調(diào)節(jié)機制。然而目前但對其表達調(diào)控的機理知之甚少，調(diào)節(jié)轉錄的上游順式作用元件尚未鑒定。

1.3 PA1b的同源異構體

PA1b屬于多基因家族，具有多種同源異構體，因而可以統(tǒng)稱為PA1b蛋白家族。迄今為止，在豌豆中已發(fā)現(xiàn)9個同源異構體[8-10]，它們絕大多數(shù)都具有殺蟲活性[9]。在黃豆、綠豆、蠶豆、菜豆、小豆、洋刀豆、扁豆、羽扇豆、黃芪等其他豆科植物中也發(fā)現(xiàn)了多種PA1b的同源異構體[11-12](表1)，這些同源蛋白質(zhì)雖然有其他不同的命名，如leginsulin(豆類胰島素)[13]、aglycin(胰安肽)[14]等，但是它們之間氨基酸序列相似性都在60%以上，均為36 ～ 39個氨基酸殘基的小肽，具有保守的ICK結構模型。這種結構模型在植物、真菌、海洋軟體動物、蜘蛛中廣泛存在，這類多肽往往具有多種生物活性，如離子通道抑制劑、蛋白酶抑制劑、抗微生物肽等。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)PA1b及其同源異構體僅存在于豆科植物中，提示PA1b家族在豆科植物進化中的重要性，尤其是其顯著的抗蟲活性，是豆科種子抵御蟲害的重要組分[15]。

表1 豆科植物中部分PA1b同源異構體序列對比

2 PA1b的生理功能

PA1b對昆蟲、植物和哺乳動物表現(xiàn)出不同的生理功能。它可能通過和特異性受體結合來發(fā)揮作用，但是在昆蟲、植物以及動物中的受體不一樣，因而有不同的作用機制。

2.1 對昆蟲的作用

PA1b對谷物象鼻蟲、蚜蟲具有顯著的殺傷力，尤其是能強力殺滅尖音庫蚊、伊蚊等傳染性病毒載體，而對蜜蜂和赤眼蜂等農(nóng)業(yè)益蟲沒有毒害作用，使得PA1b成為一種很有潛力能大規(guī)模應用的新型生物殺蟲劑[16]。總的來說PA1b殺蟲譜系為鞘翅目昆蟲，鱗翅目對此肽不敏感。然而，體外培養(yǎng)的Sf9昆蟲細胞(來源于草地夜蛾)對低劑量的PA1b敏感，提示草地夜蛾有其他機制來抵消PA1b的毒性作用[17]。

由于昆蟲主要通過消化作用吸收豆類食物中的PA1b，因而尋找PA1b在昆蟲腸道中的受體是揭示PA1b昆蟲毒作用機制的關鍵。某些PA1b不敏感昆蟲如甘藍夜蛾的腸道提取物不能降解PA1b，PA1b敏感的象鼻蟲也是如此，因此昆蟲對PA1b的耐受性差異與其腸道對PA1b降解吸收的差別無關[2]。Gressent等[18]在象鼻蟲腸細胞膜中發(fā)現(xiàn)了PA1b的一個高親和力受體，該受體為PA1b敏感的象鼻蟲品系所特有，耐藥品系中未檢測到，說明這一結合位點是PA1b昆蟲毒作用的分子靶標。后來鑒定出該受體為V型ATP酶(V-ATPase)[19]。昆蟲V-ATPase由14個亞基組成兩個復合物，嵌入膜上的復合物V0中c亞基圍成環(huán)形成質(zhì)子通道；胞質(zhì)側復合物V1則具有ATP酶活性，利用跨膜的質(zhì)子電化學梯度推動ATP的合成[20]。電生理研究表明PA1b能抑制Sf9細胞膜上的V-ATPase，阻礙其質(zhì)子泵功能，使細胞膜去極化。進一步研究發(fā)現(xiàn)PA1b結合于V-ATPase的V0復合物，進而抑制全酶活性，是V-ATPase的首個多肽類抑制劑[19]，和V-ATPase抑制劑巴弗洛霉素具有同樣的作用效果。該研究組接著[21]又利用電子顯微鏡技術揭示出PA1b和V-ATPase的具體結合位點涉及V0的c亞基環(huán)和e亞基，PA1b結合后將c亞基環(huán)"轉子"鎖定到靜態(tài)亞基e上，從而抑制了質(zhì)子泵的工作。c亞基突變導致象鼻蟲對PA1b不再敏感。在昆蟲消化道中，V-ATPase活性是昆蟲吸收營養(yǎng)物質(zhì)所必需能量的主要來源，PA1b的昆蟲毒性作用的機制在于抑制昆蟲腸道中V-ATPase活性，從而妨礙營養(yǎng)物質(zhì)吸收[22]。另一方面，PA1b昆蟲毒作用的機理還在于PA1b和昆蟲腸細胞膜上的受體V-ATPase相互作用后，激活中腸細胞內(nèi)caspase-3活性，觸發(fā)了中腸細胞凋亡，導致昆蟲死亡[23]。

為研究PA1b氨基酸殘基對其結構和殺蟲活性的影響，Da Silva等[24]化學合成了PA1b的13個突變體，每個突變體均有一個氨基酸殘基被替換成Ala(即丙氨酸突變掃描)，結果發(fā)現(xiàn)PA1b的三維結構幾乎沒有受到這些突變的影響，所有突變體和天然PA1b一樣都能抵抗蛋白酶降解，凸顯了PA1b分子結構中ICK模體的穩(wěn)定性。特別的是，PA1b和受體V-ATPase結合以及殺象鼻蟲活性依賴于Phe-10，Arg-21，Ile-23和Leu-27這幾個關鍵殘基，它們分布在PA1b的一個側面上[23-24]。

Eyraud等[25]構建了一種特殊的PA1基因載體，能夠表出達出豌豆種子中存在的PA1b的6種同源異構體形式。殺蟲試驗表明，5種具有相似的殺蟲活力，一種沒有殺蟲活性，該無活性同源異構體和其他同源異構體結構區(qū)別很大，其親水性側面變?yōu)槭杷?，因而整個分子缺乏兩親性，說明PA1b的兩親性質(zhì)是殺蟲活性必需的[25]。

2.2 對植物的作用

Leginsulin是PA1b在黃豆中的同源異構體[13]，兩者序列同源性近65%，三維結構相似性超過80%，下文合稱leginsulin/PA1b。leginsulin/PA1b在黃豆中的受體是一種43kDa蛋白[26-27]，屬于堿性7S球蛋白(basic 7S globulin, Bg7S)，能調(diào)控細胞增殖和分化[28]。在胡蘿卜細胞的培養(yǎng)基中添加leginsulin/PA1b，可以促進細胞增殖，刺激愈傷組織再分化，對照組只觀察到愈傷組織增殖，未見器官分化，說明leginsulin/PA1b與植物生長和分化的調(diào)控有關[29]。將leginsulin/PA1b基因轉入胡蘿愈傷組織中進行表達，相比對照組，轉基因的愈傷組織在分化早期生長更迅速，leginsulin基因轉入車軸草中也觀察到類似現(xiàn)象[29]。胡蘿卜中也含有l(wèi)eginsulin/PA1b的受體43kDa蛋白，因此推測leginsulin/PA1b是一種新型植物多肽激素，通過和43kDa蛋白結合并使其磷酸化而激活其酪氨酸激酶活性，從而激活細胞信號轉導，參與調(diào)控植物細胞增殖與分化。另外，趙燕英等[4]用競爭抑制ELISA法檢測了PA1b在豌豆種子萌發(fā)過程中的含量變化，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)芽時間增加，PA1b含量逐漸減少，表明PA1b可能參與豌豆發(fā)芽過程，對植物生長發(fā)育起調(diào)控作用。

Hanada等[27]利用丙氨酸突變掃描分析了19個leginsulin/PA1b突變體，發(fā)現(xiàn)對leginsulin/PA1b與43kDa蛋白結合有影響的氨基酸殘基有13個，其中能夠顯著干擾兩者結合的是C端的幾個芳香族氨基酸和疏水性氨基酸殘基，最關鍵的是Val-29和Phe-31。盡管leginsulin和PA1b的三維結構高度相似，涉及到和各自受體結合的關鍵氨基酸殘基卻是不同的，在空間上也位于分子上相反的側面，使得兩者在植物和昆蟲中的受體結合模式不同，因而具有不同的活性[24]。

2.3 對哺乳動物的作用

PA1b具有抗癌活性。體外實驗表明從發(fā)芽的黃豆中提取的leginsulin/PA1b能抑制宮頸癌細胞的增殖和促進細胞凋亡，用該提取物飼喂接種了宮頸癌細胞的裸鼠，腫瘤生長幾乎完全被抑制(腫瘤體積減少92%以上)[30]。未發(fā)芽黃豆的提取物效果次之，可能是由于發(fā)芽激活了這一活性肽的產(chǎn)生[30]，與上文所述leginsulin/PA1b在豆類種子萌發(fā)時含量最高的現(xiàn)象相符合。

PA1b還能調(diào)節(jié)哺乳動物的葡萄糖代謝和胰島素感受性，有望開發(fā)成口服的糖尿病防治藥物。外源添加PA1b能明顯延長原代大鼠胰腺β細胞存活時間，并能調(diào)節(jié)其胰島素分泌水平[6]。小鼠皮下注射Aglycin(從豬腸中分離純化而來，和PA1b氨基酸序列完全相同，兩者為同一蛋白。推測Aglycin源于食物中的PA1b被豬腸道消化吸收[31]，下文中Vglycin也是Aglycin的同源異構體，兩者僅1、2、31號氨基酸有區(qū)別)，能提升血糖濃度[31]。利用表面等離子共振(SPR)技術和肽指紋圖譜分析，鑒定出Aglycin/PA1b在小鼠胰腺中的一個與糖脂代謝相關的結合蛋白——電壓依賴陰離子選擇性通道1(voltage dependant anion-selective channel-1，VDAC-1)[31-32]。進一步的電生理研究表明PA1b使大鼠胰腺β細胞膜去極化，打開膜上的L型鈣離子通道，使細胞外鈣離子內(nèi)流從而提升胞內(nèi)鈣離子濃度，促進β細胞的分泌活動[33]。由于在植物中l(wèi)eginsulin/PA1b可與胰島素競爭結合受體堿性7S球蛋白[28]，因而推測PA1b有可能結合到哺乳動物的胰島素受體上。然而PA1b調(diào)節(jié)血糖的作用是否通過與VDAC-1、L型鈣離子通道或胰島素受體結合還在進一步研究中。

為研究PA1b在糖尿病中的作用，對鏈脲霉素(STZ)加高脂飲食誘導的2型糖尿病小鼠[14]和大鼠[34]模型給以4周的日常Aglycin/PA1b灌胃，結果有效降低了血糖水平，改善了口服葡萄糖耐受性。進一步分析模型鼠體內(nèi)胰島素相關信號分子的變化，發(fā)現(xiàn)Aglycin/PA1b的作用在于維持胰島素受體(IR)和胰島素受體底物1(IRS1)的mRNA和蛋白質(zhì)的正常表達水平，提升p-IR，p-IRS1，p-Akt和膜GLUT4(葡萄糖轉運蛋白4)蛋白的表達，從而修復糖尿病鼠的胰島素信號轉導[14]。雖然受損β細胞的胰島素合成和分泌未顯著增加，但胰島形態(tài)在Vglycin/PA1b影響下得到了改善，胰島素敏感性增加，胰腺功能得到恢復[34]。Vglycin/PA1b可通過促進β細胞增殖、抑制凋亡和分化從而補充β細胞數(shù)量，改善糖尿病鼠體內(nèi)葡萄糖自穩(wěn)平衡[35]。另外，PA1b具有良好的穩(wěn)定性，能抗胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，長期給藥安全性較好[5]。這些研究提示Aglycin/Vglycin/PA1b有開發(fā)成口服藥劑用于糖尿病的預防和治療的潛力[5,14,34-37]。

3 PA1b的異源表達

基于PA1b在農(nóng)業(yè)病蟲害防治和糖尿病藥物開發(fā)中的巨大潛力，大量獲取PA1b蛋白進行工業(yè)規(guī)模應用或者深入研究作用機制就顯得十分必要。PA1b存在許多同源異構體，它們序列非常相似，通過生物化學分離方法來逐一純化它們是很困難甚至是不可能的[6]。因此，為了研究某個特定的PA1b異構體的功能，有必要將其表達在異源系統(tǒng)中。雖然可以通過體外化學合成的方法合成有活性的PA1b[38]，但是技術復雜，耗時長耗資高，最理想的還是通過基因工程手段將PA1b在異源系統(tǒng)中進行表達。

在植物中表達PA1b的嘗試最早是Ealing等[39]報道的。由于PA1b富含半胱氨酸，他們以提高反芻動物食用的牧草中含硫蛋白質(zhì)的量為目的，將PA1基因用農(nóng)桿菌介導導入白三葉草中制備成轉基因白三葉草，結果只檢測到高水平的PA1mRNA，相應的原蛋白幾乎檢測不到，只在嫩葉中發(fā)現(xiàn)微量的PA1a，全株植物中未檢測到PA1b，說明PA1b以及絕大部分PA1a可能在蛋白加工過程中被白三葉草中內(nèi)源性蛋白酶降解了。提示異源表達PA1b必須考慮PA1前原蛋白加工過程的穩(wěn)定性問題，不能忽視PA1a的作用。2013年，Eyraud等[25]的研究結果印證了這一論點，他們利用農(nóng)桿菌侵染法將完整的PA1cDNA導入煙草葉片中，大量表達出了有活性(能夠殺傷象鼻蟲和Sf9昆蟲細胞)的PA1b(達35 mg/g鮮葉)，表達量在侵染后8天達到最大值，隨后銳減。而單獨轉化PA1b的cDNA則無法表達出PA1b，證實了PA1a的重要性。后來范亞軍等[40]也同樣用農(nóng)桿菌介導法將構建在瞬時表達載體pCAPE2上的PA1b基因轉入發(fā)芽的豌豆種子中，在豌豆植株中過表達了PA1b蛋白，為進一步研究PA1b抗蟲機制提供了基礎。另外從營養(yǎng)學角度來看，PA1b作為一種優(yōu)質(zhì)的食源性硫蛋白，在亞洲的黃豆品系中含量很高，但是北美品系中幾乎不含[41]。2015年，Krishnan等[42]用漸滲雜交技術將leginsulin/PA1b基因轉移到一種北美黃豆品系中，使之大量表達出leginsulin/PA1b，也提升了該品系的總蛋白含量，可用于制作高品質(zhì)豆腐。

PA1b在酵母中的表達見李弘劍等[43]的研究，他們將PA1b基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA上，導入GS115酵母菌中用甲醇誘導表達，培養(yǎng)基經(jīng)過超濾和HPLC分離獲得重組PA1b，得率約10 mg/L。重組PA1b對象鼻蟲敏感株表現(xiàn)出很強的毒力，而對象鼻蟲抗性株無明顯毒力，這與直接純化自豌豆種子的PA1b毒力一致。

大腸桿菌是最常用的原核表達宿主，PA1b作為真核基因在其中表達，必須考慮如何保證分子內(nèi)二硫鍵正確形成、肽鏈正確折疊等因素。在大腸桿菌中表達出有活性PA1b的報道最早見于2003年，Hanada等[27]在BL21大腸桿菌中導入完整的PA1基因，能表達出具有活性的leginsulin/PA1b，分子內(nèi)二硫鍵正確，也能和受體43kDa蛋白結合。杜雯等[44]將PA1b對應的cDNA與麥芽糖結合蛋白(MBP)基因構建成融合基因在大腸桿菌DH5α中進行了可溶性表達，然而細菌周質(zhì)空間中表達量太低，以及融合蛋白中MBP標簽去除需經(jīng)Factor Xa酶切成本高，因而并無后續(xù)。另有Louis等[10]嘗試在大腸桿菌中表達PA1b，僅轉化PA1b對應的cDNA，結果顯示盡管形成了3對二硫鍵，PA1b的產(chǎn)量非常低，而且是沒有正確折疊的無活性形式。因此，推測PA1a在翻譯后加工過程中起著重要作用，它可能作為分子伴侶有助于PA1b正確折疊，從而保證PA1b獲得相應的生物活性。最近，黃敏華等[45]將Aglycin/PA1b通過一個能在體外進行自剪切的內(nèi)含肽MxeGyrA與自組裝肽ELK16連接，構建了重組表達載體pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16，轉化入大腸桿菌BL21進行蛋白誘導表達，得到目的蛋白聚集體，隨后進行DTT切割，最終得到純度為98.15%、產(chǎn)量為5.53 mg/g菌體濕重的Aglycin肽。該肽有比阿卡波糖更強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，證明其有開發(fā)為降糖藥劑的潛力。

4 PA1b的應用與展望

PA1b調(diào)節(jié)血糖的活性已經(jīng)在多項細胞和活體實驗研究中得到證實。PA1b為豆科植物所特有，對于人和其他哺乳動物來說是一種安全的食源性含硫蛋白，食用后沒有毒性和變應原性，而且可以耐受胃蛋白酶的降解，在腸道中保持活性。因而PA1b具有開發(fā)成口服降糖藥物的廣闊應用前景。

PA1b的另一顯著活性是昆蟲毒性，可開發(fā)成一種理想的生物殺蟲劑。它能特異性殺害象鼻蟲、蚜蟲等害蟲而不損害蜜蜂等益蟲，因而可大規(guī)模應用。PA1b蛋白家族賦予豆類種子特異的殺蟲活性，在糧食儲藏和飼料加工中可適量添加豆粉，使糧食和飼料抵抗害蟲侵蝕從而更耐儲藏，減少化學保藏劑的有害作用[46]。此外，面包制作中添加少量豌豆粉水解物可使面包在室溫下至少儲藏21天而不染真菌，同添加0.3%丙酸鈣一樣具有防腐效果，水解物中抗真菌多肽成分之一被鑒定為PA1b[47]，說明PA1b可能開發(fā)成安全的食品防腐劑。

PA1b化學本質(zhì)是多肽，可用基因工程技術進行異源表達，從而大量制備。在異源表達系統(tǒng)中如何提升PA1b的表達量，以及如何促進PA1b正確折疊成活性形式是需要重點考慮的問題。鑒于PA1b同源異構體之間活性存在差異，隨著對PA1b結構與功能關系的研究不斷深入，將有可能開發(fā)出氨基酸序列更優(yōu)化的重組PA1b來增強其活性，擴展應用范圍。