用于卵母細(xì)胞玻璃化保存的微流控系統(tǒng)

張宇琪 喻梓瑄 周新麗

（上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093）

卵母細(xì)胞的玻璃化保存是輔助生殖的常用技術(shù)，可為由于年齡及醫(yī)療因素引起的卵巢功能衰退的女性保存生育能力[1-4]，對(duì)珍貴瀕危物種保種擴(kuò)繁也具有重要意義[5]。實(shí)現(xiàn)玻璃化保存通常需要在細(xì)胞內(nèi)外加載高濃度的低溫保護(hù)劑[6]，為減少高濃度的低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞造成的滲透損傷，需要采用分步法加載和去除低溫保護(hù)劑。目前，臨床上采用多步平衡法對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保護(hù)劑的加載和去除[7-8],雖在一定程度上減少了滲透損傷[9]，但仍存在細(xì)胞外溶液滲透壓階梯狀突變，操作過程中極易造成細(xì)胞丟失等問題。此外，目前卵母細(xì)胞的玻璃化保存全部由人工操作，不僅對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，而且完成效率低。隨著保存需求的逐年增大，人工操作逐漸難以滿足保存需求，且人為因素存在一定的不確定性，所以開發(fā)卵母細(xì)胞自動(dòng)玻璃化保存一體化裝置十分必要。

微流控芯片可對(duì)微量流體進(jìn)行復(fù)雜、精確的操作，在單細(xì)胞分析、基因測(cè)序、蛋白質(zhì)結(jié)晶等方面發(fā)揮獨(dú)特的作用[10]。近年來研究者們研發(fā)了微流控生物芯片用于生育力保存，包括配子與胚胎的篩選、體外培養(yǎng)、體外受精以及低溫保存等[11]。Y. S. Heo等[12]使用微流控芯片對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保護(hù)劑的加載，但該芯片有幾個(gè)不同的通道高度且需要?dú)鈩?dòng)閥控制流體，制造工藝較為繁瑣。周新麗等[13-14]設(shè)計(jì)了一種在保護(hù)劑加載/去除過程中能使低溫保護(hù)劑濃度連續(xù)變化的微流控細(xì)胞處理芯片，操作時(shí)低溫保護(hù)劑經(jīng)蛇形通道混合流入細(xì)胞操作腔，但細(xì)胞進(jìn)出操作腔需通過使用口吸器人工控制，完成低溫保護(hù)劑加載后還需要將細(xì)胞從芯片中取出，再加載至載體上進(jìn)行冷凍，增加了操作難度，不利于卵母細(xì)胞自動(dòng)玻璃化保存的實(shí)現(xiàn)。以上兩種芯片均采用軟光刻法制作的PDMS芯片，需要經(jīng)過光刻開模，倒膠成型、分層鍵合等步驟，工藝較為復(fù)雜，且制作成本較高。

目前，已有研究人員開發(fā)研制了幾款卵母細(xì)胞及胚胎自動(dòng)玻璃化保存裝置。Liu Jun等[15]設(shè)計(jì)了胚胎自動(dòng)玻璃化及復(fù)溫機(jī)器人，通過顯微鏡與相機(jī)定位胚胎位置，并通過機(jī)器人操作手進(jìn)行胚胎玻璃化冷凍，但由于細(xì)胞在溶液中的位置無法固定，移動(dòng)操作耗時(shí)較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移過程還易出現(xiàn)細(xì)胞丟失問題。M. Dal Canto等[16]研發(fā)了一款自動(dòng)玻璃化保存裝置，包含獨(dú)立的機(jī)器人移液處理單元，可以向冷凍載體Pod中分兩步加入并吸走低溫保護(hù)劑，但該裝置無法用于樣品復(fù)溫后的低溫保護(hù)劑去除操作，自動(dòng)玻璃化保存流程不夠完整?，F(xiàn)有的卵母細(xì)胞及胚胎自動(dòng)玻璃化裝置多采用自動(dòng)化機(jī)械手臂替代了分步法低溫保護(hù)劑加載與去除過程中的人工操作，但仍存在滲透壓突變以及細(xì)胞容易丟失的問題。采用微流控裝置對(duì)卵母細(xì)胞或胚胎進(jìn)行保護(hù)劑加載和去除，并可用于后續(xù)自動(dòng)玻璃化保存的裝置還未見報(bào)道。

本文設(shè)計(jì)制作了一個(gè)用于卵母細(xì)胞玻璃化保存的微流控系統(tǒng)，既實(shí)現(xiàn)了低溫保護(hù)劑的連續(xù)加載/去除，又為后續(xù)浸入液氮實(shí)現(xiàn)自動(dòng)玻璃化保存做好準(zhǔn)備。首先，采用CO2激光雕刻法制作了用于低溫保護(hù)劑連續(xù)加載/去除的微流控芯片，結(jié)合石英毛細(xì)管搭建微流控混合系統(tǒng)；然后，利用灰度值法與折光儀法，驗(yàn)證微流控芯片的混合效率和濃度變化規(guī)律；最后，對(duì)比手動(dòng)多步平衡法與微流體法加載/去除保護(hù)劑時(shí)卵母細(xì)胞的體積響應(yīng)、存活率和后續(xù)發(fā)育率。本研究為基于微流控技術(shù)的卵母細(xì)胞與胚胎的自動(dòng)玻璃化保存裝置的研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二甲基亞砜，乙二醇，蔗糖（美國Sigma-Aldrich公司）；TCM199（美國Gibco公司 12340030）；M2培養(yǎng)液，KSOM培養(yǎng)液（江蘇易核科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（中國蘇凈集團(tuán)安泰公司 Airtech）；體視顯微鏡（日本MOTIC SMZ-168）；高速工業(yè)相機(jī)（深圳市英視科技有限公司 OSG130-210UM）；CO2培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司 3111/3131）；CO2激光雕刻機(jī)（美國 UNIVERSAL VLS2.30）。

1.2 主要溶液配置

所用溶液的濃度均指體積分?jǐn)?shù)?；A(chǔ)液BS：TCM199+20%FBS；平衡溶液ES: 7.5%EG+7.5%DMSO+基礎(chǔ)液；玻璃化溶液VS：15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+基礎(chǔ)液；復(fù)溫溶液TS:1 mol/L蔗糖+基礎(chǔ)液；稀釋溶液DS:0.5 mol/L蔗糖+基礎(chǔ)液；透明質(zhì)酸酶溶液：TCM199+0.1%透明質(zhì)酸酶；孤雌激活溶液：M2培養(yǎng)液+5 μg/mL細(xì)胞松弛素B。

1.3 小鼠卵母細(xì)胞采集

每批取10只雌性小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin, PMSG） 10 IU，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin, HCG） 10 IU。在注射HCG后14～16 h內(nèi)脫頸處死小鼠，剖開腹腔，取輸卵管部分，將輸卵管轉(zhuǎn)移至含有M2培養(yǎng)液的表面皿中，沖洗干凈。在體視顯微鏡操作臺(tái)上，找到輸卵管膨大部并用眼科針?biāo)洪_，排出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物。再將卵母細(xì)胞團(tuán)移至含透明質(zhì)酸酶M2培養(yǎng)液中處理3～5 min反復(fù)吹打使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離獲得裸卵，洗滌3～5次后挑選形態(tài)正常卵母細(xì)胞移入事先制備好的M2培養(yǎng)液液滴中，放入培養(yǎng)箱備用。

圖1 微流控芯片三層結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of three layers of microfluidic chip

1.4 微流控混合系統(tǒng)的搭建

3、林地監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，2012年庫區(qū)耕地4429997.22畝，2017年4377062.65畝，五年間林地面積減少52934.57畝。區(qū)域退耕還林政策的實(shí)施導(dǎo)致庫區(qū)內(nèi)林地有所增加。林地減少的主要因素是建設(shè)占用和水庫淹沒。

2018年以來更是動(dòng)作頻頻，夢(mèng)妝入駐美國最大美妝零售商ULTA，悅詩風(fēng)吟成功進(jìn)軍日本，彩妝品牌赫妍與專業(yè)美發(fā)品牌AMOS PROFESSIONAL也成功登陸新加坡，蘭芝正式進(jìn)駐澳大利亞所有絲芙蘭門店，而伊蒂之屋在進(jìn)駐迪拜后，預(yù)計(jì)將進(jìn)駐中東最大美妝市場(chǎng)——沙特阿拉伯。

圖2 微流控混合系統(tǒng)連接示意圖Fig.2 Connection diagram of microfluidic mixing system

1.5 微流控混合系統(tǒng)的溶液混合

將玻璃化溶液（15%EG+15%DMSO+ 0.5 mol/L蔗糖+BS）和解凍溶液（1 mol/L蔗糖+ BS）用普通紅色染料染色，結(jié)合試劑反應(yīng)法中的色彩分析方法定量分析微通道混合效果。微流控芯片置于光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上，將含染料的玻璃化溶液和基礎(chǔ)溶液各載入一支 1 mL的微量進(jìn)樣針中，固定于一臺(tái)微注射泵上，設(shè)置注射流速為15 μL/min。運(yùn)行載有基礎(chǔ)溶液的注射泵，排盡微通道內(nèi)的空氣，啟動(dòng)兩臺(tái)注射泵，待通道內(nèi)流體穩(wěn)定后，按圖3檢測(cè)點(diǎn)（A～G）設(shè)置，拍攝相應(yīng)位置處微通道的圖像，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)拍攝10張圖像，使用3塊芯片重復(fù)實(shí)驗(yàn)。拍攝結(jié)束后，更換芯片并換用含染料的去除溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

圖3 S型通道檢測(cè)點(diǎn)設(shè)置Fig.3 Detection point setting of S-type channel

1.6 低溫保護(hù)劑加載和去除

楊云等[14]對(duì)比了一步法、多步法和PDMS芯片加載低溫保護(hù)劑對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞體積變化和后續(xù)發(fā)育的影響，結(jié)果表明，PDMS線性加載組的卵母細(xì)胞囊胚率（27.4%）顯著高于一步法組（8.3%）和多步法組（15.5%）。衣星越等[19]對(duì)比了一步法、兩步法和PDMS芯片去除低溫保護(hù)劑對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞體積變化和后續(xù)發(fā)育的影響，微流控法去除低溫保護(hù)劑后，卵母細(xì)胞的存活率、體外發(fā)育情況等均優(yōu)于分步去除方法。以上研究中所使用的芯片通道尺寸約為100 μm，采用軟光刻技術(shù)PDMS材料加工，工藝復(fù)雜，且卵母細(xì)胞位于芯片分析腔中，不能進(jìn)行后續(xù)的玻璃化冷凍。而本研究改用寬度約200 μm的通道，采用CO2激光雕刻法對(duì)PMMA材質(zhì)進(jìn)行加工，工藝簡(jiǎn)便且同樣能夠?qū)崿F(xiàn)低溫保護(hù)劑濃度的線性變化。采用本系統(tǒng)的微流體法8 min組，卵母細(xì)胞的囊胚率（53.0%）與對(duì)照組無明顯差異，說明PMMA芯片加載和去除低溫保護(hù)劑可以有效減小卵母細(xì)胞的滲透損傷，且結(jié)合使用石英毛細(xì)管更有利于卵母細(xì)胞后續(xù)的玻璃化冷凍和復(fù)溫操作。

微流控法：將3～5枚卵母細(xì)胞固定在石英毛細(xì)管內(nèi)，不銹鋼微絲從毛細(xì)管末端插入。將VS溶液與BS溶液各載入一支1 mL 的微量進(jìn)樣針中分別固定在兩臺(tái)注射泵上，設(shè)置VS注射參數(shù)為0～30 μL/min，BS注射參數(shù)為30～0 μL/min，加載時(shí)間為8 min。在流速參數(shù)不變的情況下，設(shè)置加載和去除時(shí)間分別為6 min、10 min重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.7 圖像采集

在進(jìn)行卵母細(xì)胞的低溫保護(hù)劑加載與去除的過程中，使用工業(yè)相機(jī)拍攝細(xì)胞在溶液中的體積動(dòng)態(tài)變化過程，因細(xì)胞在高滲溶液中體積變化較為迅速，故設(shè)置相機(jī)拍攝參數(shù)為10 s拍攝1張圖片，以保證圖像信息的完整性。將卵母細(xì)胞假設(shè)為理想的球體，利用圖形處理軟件分析所拍攝圖像中每一枚卵母細(xì)胞的投影面積，根據(jù)球體與投影面積換算公式（1）計(jì)算得到卵母細(xì)胞的體積。

（1）

式中：V為卵母細(xì)胞體積,μm3；S為卵母細(xì)胞投影面積,μm2。

微通道內(nèi)各處混合情況如圖4所示，在入口處低溫保護(hù)劑溶液已有少許擴(kuò)散現(xiàn)象，而去除溶液無明顯擴(kuò)散現(xiàn)象，但兩種溶液均在入口分層明顯。檢測(cè)點(diǎn)A能觀察到兩種溶液均有明顯的分層現(xiàn)象，而檢測(cè)點(diǎn)B分層現(xiàn)象已不顯著，在出口處已完全觀察不到分層現(xiàn)象。

1.8 卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率判斷

完成低溫保護(hù)劑的去除后將所有卵母細(xì)胞吹入M2培養(yǎng)液中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后觀察細(xì)胞存活狀態(tài)。以透明帶完整無明顯變形且卵周間隙均勻，質(zhì)膜完整，胞質(zhì)無外流現(xiàn)象，胞質(zhì)無皺縮、變暗或松散不均勻現(xiàn)象為存活標(biāo)準(zhǔn)。觀察結(jié)束后將細(xì)胞移入孤雌激活溶液中，并放入培養(yǎng)箱中激活處理5 min，然后用M2培養(yǎng)液清洗數(shù)次移入KSOM培養(yǎng)液液滴中培養(yǎng)。在激活后16～18 h內(nèi)觀察判斷激活結(jié)果，若出現(xiàn)原核或發(fā)生卵裂則判定為激活成功，若質(zhì)膜破裂皺縮則判定為死亡，若無明顯變化則判定為退化。在激活后的48 h觀察并計(jì)算卵裂率，挑選卵裂胚胎換液培養(yǎng)，第4天觀察發(fā)育情況并計(jì)算囊胚率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次，每組共處理 30枚卵母細(xì)胞。采用Origin 2021軟件中One way ANOVA、Tukey方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05作為差異顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

蔡飛等[12-14]發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，血府逐瘀湯含藥血清可以增加人微血管內(nèi)皮株（HMEC-1）細(xì)胞活性，增加內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附和血管腔形成能力。在非缺氧條件下，血府逐瘀湯含藥血清可以促進(jìn)血管數(shù)量的增加。同時(shí)不同濃度含藥血清均可影響堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的轉(zhuǎn)錄水平和濃度，通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的多環(huán)節(jié)干預(yù)調(diào)節(jié)，促進(jìn)血管新生。研究發(fā)現(xiàn)不同濃度含藥血清可以下調(diào)EphB4和EphrinB2基因表達(dá)，其促血管新生機(jī)制與EphB4/EphrinB2密切相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微通道混合效率與溶液濃度變化分析

來一場(chǎng)說走就走的旅行，不是任性，而是實(shí)屬無奈。原本手頭上的事情太多，十一長(zhǎng)假也準(zhǔn)備好好“奮斗”一番，誰想一通電話的相約，孩子歡呼雀躍吵著要走，如一枚石子驟然敲破平鏡的湖面。計(jì)劃亂了，但心之所動(dòng)，已飄向了旅途的遠(yuǎn)方。

圖4 通道內(nèi)混合情況Fig.4 Mixing in the channel

多步平衡法與微流體法對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保護(hù)劑加載和去除過程中，卵母細(xì)胞的體積變化趨勢(shì)如圖7所示。由圖7可知，采用多步平衡法處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)多次劇烈縮脹現(xiàn)象。細(xì)胞在分別浸入ES、VS、TS時(shí)最快收縮速率達(dá)0.834%、0.987%、0.855%V0/s，最小歸一化體積分別達(dá)到0.496 5、0.546 7、0.443 1。而使用微流體法加載和去除低溫保護(hù)劑時(shí)，可明顯觀察到體積變化更為平緩，整個(gè)過程的最大最小歸一化體積僅分別為1.118 4和0.903 8，接近初始體積。

在芯片頂層的溶液進(jìn)出口處用外徑0.6 mm的鋼針和內(nèi)徑0.5 mm的硅膠管連接，利用 UV光固膠固定和密封，避免溶液泄漏。微流控芯片溶液入口處的兩根硅膠管另一端各連接一臺(tái)微量注射泵。冷凍載體石英毛細(xì)管兩端均開口，其中一端為長(zhǎng)1 cm、直徑2.8 mm的漏斗。魯爾接頭一端插入石英毛細(xì)管漏斗端，另一端通過硅膠管與微流控芯片相連微流控混合系統(tǒng)連接，如圖2所示。

圖5 通道混合指數(shù)Fig.5 Mixing index of channel

采用折光法對(duì)比了低溫保護(hù)劑溶液和去除溶液在相同總流速、不同注射時(shí)間和流速比例下，芯片出口處溶液的濃度變化，如圖6所示。在保護(hù)劑加載時(shí)間為6、8、10 min時(shí)，溶液濃度的折光率均呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，混合溶液的初始折光率為1.335，最終折光率為1.415。隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，出口溶液折光率增長(zhǎng)速率降低，均可在注射過程中實(shí)現(xiàn)濃度由基礎(chǔ)液至玻璃化溶液的線性轉(zhuǎn)變；在保護(hù)劑去除時(shí)間為6、8、10 min時(shí)，溶液濃度的折光率均呈線性降低趨勢(shì)，隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，混合溶液折光率降低速率減小，均實(shí)現(xiàn)了濃度由復(fù)溫溶液至基礎(chǔ)液的線性轉(zhuǎn)變。綜上說明，PMMA芯片可以實(shí)現(xiàn)在低溫保護(hù)劑溶液流速線性增大或去除溶液流速線性減小的情況下，混合溶液的濃度也隨之線性增大或減小。

圖6 通道出口處溶液折光率Fig.6 Refractive index of the solution at the exit of the channel

2.2 微流控法與多步平衡法對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究

通過拍照并計(jì)算各檢測(cè)點(diǎn)的混合指數(shù)，定量分析PMMA芯片混合系統(tǒng)的混合效率，計(jì)算結(jié)果如圖5所示。混合過程中，低溫保護(hù)劑溶液在40 mm處的混合指數(shù)達(dá)到0.998 5；而去除溶液則在55 mm處混合指數(shù)才達(dá)到0.992 6。這是由于去除溶液中蔗糖含量較高，使溶液黏度增大，流動(dòng)性降低，混合效率降低。計(jì)算結(jié)果說明低溫保護(hù)劑溶液和去除溶液均能在通道出口處完全混合，PMMA混合芯片符合溶液混合需求。

圖7 不同加載/去除方案卵母細(xì)胞體積變化Fig.7 Volume changes of oocytes in different loading/removal schemes

在使用微流體法處理細(xì)胞的整個(gè)過程中，卵母細(xì)胞雖有膨脹縮小現(xiàn)象，但一直保持著良好的球形度，不同于多步平衡法中，細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則收縮。原因可能是多步平衡法中存在溶液混合不均勻或不完全的現(xiàn)象，使細(xì)胞周圍出現(xiàn)溶液濃度梯度，導(dǎo)致胞內(nèi)水分優(yōu)先從濃度更高的一側(cè)流出，形成坑狀變形，造成細(xì)胞的滲透損傷[17]。而微流體法可使細(xì)胞外溶液濃度逐漸且均勻地變化，從而降低細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差，使細(xì)胞形態(tài)均勻改變。Lai D.等[18]研究了卵母細(xì)胞玻璃化溶液的微流體法加載過程，結(jié)果表明，該方法使卵母細(xì)胞在低溫保護(hù)劑加載過程中保持較高的球形度，從而顯著降低卵母細(xì)胞膜損傷，增強(qiáng)其后續(xù)發(fā)育能力。綜上說明，微流控混合系統(tǒng)和毛細(xì)管載體的組合可使卵母細(xì)胞在保護(hù)劑加載和去除過程中做出體積響應(yīng)，并能有效減小體積變化程度，減緩體積變化速率，最終減小滲透損傷。

表1所示為多步平衡法與微流體法加載和去除保護(hù)劑后卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的結(jié)果，使用微流體法加載和去除保護(hù)劑后，卵母細(xì)胞的存活率（93.25%）顯著高于多步平衡法組（79.75%），與對(duì)照組（97.74%）無顯著性差異。微流體法組的卵裂率（77.12%）和囊胚率（53.00%）均高于多步平衡法組（58.74%、37.73%）。說明微流體法可有效減小卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載與去除過程的滲透損傷，提高低溫保護(hù)劑去除后的細(xì)胞存活率與發(fā)育率。

腦卒中在臨床中比較常見，有著較高的致殘率，如果沒有及時(shí)處理，會(huì)影響到患者的生活質(zhì)量和水平。經(jīng)過相關(guān)研究，患者在出現(xiàn)腦卒中之后，相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)還具備一定的自然恢復(fù)功能，具備一定的神經(jīng)功能。在康復(fù)治療中，需要恢復(fù)這些功能，同時(shí)利用加速腦側(cè)枝循環(huán)的構(gòu)建，促進(jìn)側(cè)腦組織或者病灶周圍組織的補(bǔ)償和重組[1] 。所以，使用有效治療方法和合理康復(fù)介入實(shí)際可以顯著恢復(fù)患者的神經(jīng)功能，改善患者的生活自理能力。在臨床康復(fù)治療中，腦梗死患者一般在一周之內(nèi)，少數(shù)的在兩天之內(nèi)，腦出血的患者需要在兩周之內(nèi)介入康復(fù)治療[2] 。

表1 多步平衡法與微流體法加載/去除方案對(duì)卵母細(xì)胞存活與發(fā)育的影響Tab.1 Effects of multi-step and microfluidic loading-removal method on oocyte survival and development rate

2.3 微流體法不同低溫保護(hù)劑加載/去除時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞的影響

圖8 微流體法不同注射時(shí)間卵母細(xì)胞體積變化Fig.8 Changes of oocyte volume at different injection times by microfluidic method

圖8所示為卵母細(xì)胞在使用微流體法進(jìn)行低溫保護(hù)劑加載/去除時(shí)不同加載/去除時(shí)間的體積變化。由圖8可知，隨著加載/去除時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞體積變化程度顯著減小，且體積變化速率減緩，細(xì)胞在加載/去除時(shí)間均為6 min時(shí)，最大和最小歸一化體積分別達(dá)到1.221和0.839。10 min 時(shí)，細(xì)胞的最大和最小歸一化體積僅為1.041 3和0.928 5，相比于6 min 組和8 min 組，加載過程體積改變的程度可減小約8.95%、6.48%，去除過程體積改變程度可減小約17.97%、7.71%。說明注射時(shí)間延長(zhǎng)可減緩胞外溶液濃度變化速率，縮小胞內(nèi)外濃度差，從而使細(xì)胞體積變化趨于平緩，最后達(dá)到滲透平衡時(shí)體積也更接近初始體積。

色譜條件：Shimadzu-GL ODS-2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（75∶25）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm；進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃。

表2所示為微流體法不同注射時(shí)間加載/去除保護(hù)劑后卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的結(jié)果。由表2可知，微流控法8 min組的存活率（93.25%）顯著高于其余兩組。經(jīng)化學(xué)激活培養(yǎng)后，微流控6 min組的卵裂率（67.17%）與10 min組（68.38%）之間無顯著性差異，但顯著低于8 min 組（77.12%）。對(duì)比培養(yǎng)4 d后的囊胚率可發(fā)現(xiàn)，6 min組的囊胚率（45.17%）與10 min 組（47.43%）無顯著性差異但卻低于8 min組（53.00%）。這可能是因?yàn)? min組處理時(shí)間較短，相對(duì)于其余兩組胞外溶液濃度變化速率更快，細(xì)胞體積變化更為劇烈，所造成的滲透損傷也更大。而10 min組處理時(shí)間過長(zhǎng)，雖在減小滲透損傷層面有一定優(yōu)勢(shì)，但卻增大卵母細(xì)胞的毒性損傷，不利于其后期的生長(zhǎng)與發(fā)育。因此，微流體法8 min組在溶液濃度變化速率和處理時(shí)間上具有一定優(yōu)勢(shì)，可提高卵母細(xì)胞的玻璃化保存效果。

采用多步平衡法與微流控法分別對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保護(hù)劑的加載和去除。多步平衡法加載：將3～5枚卵母細(xì)胞移至基礎(chǔ)液中平衡3 min，轉(zhuǎn)至ES溶液中平衡6 min，再將細(xì)胞移至VS溶液中平衡1 min；多步平衡去除：將卵母細(xì)胞移至TS 溶液中平衡1 min，然后移至DS溶液中稀釋5 min，最后移至BS溶液中洗滌3 min。

鋼纖維混凝土的組成它包含了兩種部分，即纖維性材料、顆粒性材料混合而成的，在實(shí)踐過程中，鋼纖維混凝土中包含了鋼纖維，使得整體材料的就結(jié)構(gòu)具備抗沖擊、抗折、抗疲勞等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的混泥土相比質(zhì)量強(qiáng)度由于傳統(tǒng)混凝土材料，正是如此，在道路橋梁施工中該材料得到了廣泛的應(yīng)用。

表2 微流體法不同注射時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞存活與發(fā)育的影響Tab.2 Effects of different injection time on oocyte survival and development rate in microfluidic method

3 總結(jié)與展望

本文設(shè)計(jì)制作了一種用于卵母細(xì)胞玻璃化保存的微流控系統(tǒng)，并從流體混合和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面對(duì)系統(tǒng)功能進(jìn)行驗(yàn)證，得到結(jié)論如下：

1）使用石英毛細(xì)管作為低溫保護(hù)劑加載/去除以及細(xì)胞冷凍載體，一體兩用簡(jiǎn)化了原有的細(xì)胞進(jìn)入及取出芯片的方式。

微流控通道結(jié)構(gòu)包括頂層、通道層和底層，如圖1所示。流體混合通道為深0.5 mm、寬0.2 mm，總長(zhǎng)度60 mm的S型通道。微流控芯片通過CO2激光雕刻法制作，選擇厚1 mm的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）板材為頂層，0.5 mm PMMA板材為通道層和底層，且通道層板材雙面預(yù)先貼好光學(xué)級(jí)雙面膠，將板材放入雕刻機(jī)中分別雕刻出三層，再放入超聲波清洗機(jī)中清洗 20 min，取出烘干30 min，放入真空貼合機(jī)中常溫鍵合。

我認(rèn)識(shí)遲羽那會(huì)兒她才十六歲，剛滿了最低年齡限制就跑去國外考了個(gè)PADI的探險(xiǎn)潛水員證書。此后每次見她，她都會(huì)告訴我最近又玩了什么新項(xiàng)目：蹦極、滑板、雪板、賽車、空中沖浪……

2）使用CO2激光雕刻法批量制作PMMA芯片，簡(jiǎn)化了芯片加工工藝，節(jié)省加工成本?；叶戎捣@示兩種溶液均可在通道出口處完全混合均勻，低溫保護(hù)劑溶液所需混合長(zhǎng)度為40 mm，去除溶液所需混合長(zhǎng)度為55 mm，折光儀法測(cè)試保護(hù)劑溶液和去除溶液均可在通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)溶液濃度線性變化，所設(shè)計(jì)的 PMMA 混合系統(tǒng)可滿足實(shí)驗(yàn)需求。

3）微流體法與多步平衡法相比體積變化速率可降至0.211 7%V0/s，并顯著提高卵母細(xì)胞的存活率與激活處理后的發(fā)育率。微流體法的3組中，8 min 組的存活率、卵裂率和囊胚率（93.25%、77.12%、53%）顯著高于其余2組，且存活率和囊胚率與對(duì)照組無顯著性差異。

微流體混合系統(tǒng)的使用優(yōu)化了卵母細(xì)胞玻璃化保存步驟，為卵母細(xì)胞及胚胎的自動(dòng)玻璃化保存及一體化裝置的研制提供了新思路。下一步將開發(fā)基于微流控技術(shù)的卵母細(xì)胞及胚胎自動(dòng)玻璃化保存裝置，實(shí)現(xiàn)高自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的卵母細(xì)胞及胚胎玻璃化保存。

本文受上海市促進(jìn)市級(jí)醫(yī)院臨床技能與臨床創(chuàng)新能力三年行動(dòng)計(jì)劃重大臨床研究項(xiàng)目（SHDC2020CR3077B）資助。（The project was supported by Clinical Research Plan of SHDC（No.SHDC2020CR3077B）.）