基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析酸脅迫影響鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的機(jī)理

楊克慧，董鵬程，劉昀閣，張一敏,2，毛衍偉，梁榮蓉，羅 欣,2,3，朱立賢,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，山東 泰安 271018；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

沙門氏菌廣泛存在于牛、羊、豬、家禽、鳥類等多種動(dòng)物的腸道及內(nèi)臟，并通過糞便傳播，可導(dǎo)致人類發(fā)燒、腸胃炎、敗血癥等多種疾病，是世界范圍內(nèi)引起食品公共安全問題的主要食源性致病菌之一[1]。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是與人類沙門氏菌病相關(guān)的重要血清型，每年在全世界造成約13億 例胃腸炎、1 600萬 例傷寒和300萬 人死亡[2]。為此，食品工業(yè)已經(jīng)制定了各種控制措施消減微生物，通常采用乳酸、檸檬酸、過氧乙酸等有機(jī)酸噴淋來消除肉類及蔬菜上的沙門氏菌[3-5]。但長期以及不適當(dāng)?shù)乃崽幚頃?huì)使沙門氏菌處于一種弱酸的脅迫環(huán)境，進(jìn)而誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐酸反應(yīng)（acid tolerance response，ATR）。類似地，在肉牛屠宰加工時(shí)，新鮮胴體的微生物通常來源于糞便或皮毛[6]。畜禽屠宰后胴體肌糖原降解產(chǎn)生乳酸、ATP分解產(chǎn)生磷酸根離子等會(huì)使胴體pH值下降到5.4左右，這種弱酸環(huán)境也會(huì)使沙門氏菌產(chǎn)生酸脅迫，進(jìn)而產(chǎn)生ATR[7]。

ATR是指沙門氏菌經(jīng)過溫和酸脅迫后，在強(qiáng)酸致死條件下耐受能力增強(qiáng)的現(xiàn)象。沙門氏菌存在多種與ATR相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，包括RpoS、Fur以及雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)OmpR/EnvZ和PhoP/PhoQ等，能夠誘導(dǎo)酸休克蛋白的表達(dá)，進(jìn)而防止或修復(fù)酸應(yīng)激引起的大分子損傷[8]。此外，精氨酸代謝系統(tǒng)能夠通過脫羧作用消耗細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子，維持穩(wěn)定的胞內(nèi)pH值[9]；ATP合酶系統(tǒng)通過質(zhì)子排出產(chǎn)生質(zhì)子遷移力，促進(jìn)胞內(nèi)多余質(zhì)子排出，維持胞內(nèi)pH值和細(xì)胞存活[10]。同時(shí)，經(jīng)酸應(yīng)激后鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因cfa的表達(dá)水平顯著升高，增加細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸含量，降低細(xì)胞膜對(duì)H+通透性，進(jìn)一步降低質(zhì)子流入胞質(zhì)的程度[11]。目前對(duì)于沙門氏菌ATR的研究多集中于酸應(yīng)激后其相應(yīng)機(jī)制的探討[12]，而溫和酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌ATR、交叉保護(hù)及毒力因子的相關(guān)影響機(jī)制尚不完全清楚。

此外，鼠傷寒沙門氏菌在強(qiáng)酸環(huán)境下仍可以存活并引起人類疾病，說明其具有較強(qiáng)的耐酸性以及在食品中形成危害的潛力。沙門氏菌產(chǎn)生ATR的因素有很多，除酸脅迫條件（脅迫pH值、溫度、時(shí)間等）、酸激條件和培養(yǎng)基成分外，血清型和菌株特性也是重要的影響因素[13]。Lianou等[14]評(píng)估了酸脅迫對(duì)不同血清型及同一血清型不同來源沙門氏菌產(chǎn)生的ATR，結(jié)果表明沙門氏菌ATR的產(chǎn)生具有菌株依賴性。深入了解酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌ATR的影響機(jī)制，可以揭示ATR產(chǎn)生的真實(shí)規(guī)律，有助于針對(duì)性地制定控制和消除ATR的策略。為此，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)分析酸脅迫（pH 5.4）和非酸脅迫條件下鼠傷寒沙門氏菌轉(zhuǎn)錄反應(yīng)特征，并通過DEGs富集分析闡明鼠傷寒沙門氏菌與酸脅迫相關(guān)的生物學(xué)途徑，進(jìn)一步明確酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌ATR及其他交叉保護(hù)抗性的產(chǎn)生機(jī)制，以期為鼠傷寒沙門氏菌在肉制品中的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室保藏。

LB（Luria-Bertani）肉湯、LB瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；鹽酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR）、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒（SYBR?Green Premix ProTaqHS qPCR Kit II）湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G154DWS滅菌鍋 廈門致微公司；HF safe-MJQ1型紅外線滅菌器 上海力申科學(xué)儀器有限公司；1300 SERISES A2生物安全柜 美國Thermo Scientific公司；細(xì)菌培養(yǎng)皿 美國康寧公司；Gene Quant微量核酸蛋白測定儀 英國Biochrom公司；PTC-200 PCR儀、CFX 96 real-time PCR檢測系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；2100生物分析儀 美國Agilent公司；5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及酸脅迫處理

將保存于-80 ℃的鼠傷寒沙門氏菌接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h活化2次。參照田牧雨等[15]的方法并稍作修改，取活化后菌液接種于pH 7.2的LB培養(yǎng)基（非酸脅迫對(duì)照組）及pH 5.4、5.0和4.5的LB培養(yǎng)基（3 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)，酸脅迫處理組）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h， 4 ℃、10 000×g離心10 min，去除上清液，無菌PBS洗滌菌體3次，收集菌體保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的測定

參照Ye Beining等[16]的方法并稍作修改，將各酸脅迫組和非酸脅迫組鼠傷寒沙門氏菌調(diào)整菌液濃度為7（lg（CFU/mL）），取1 mL菌液接種于9 mL pH 3的LB中（3 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)），37 ℃酸激2 h。取酸激0 h和2 h菌液梯度稀釋并涂布于LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。存活率為酸激2 h后菌落數(shù)與初始菌落數(shù)之比（%）。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 RNA提取、文庫構(gòu)建及測序

對(duì)上述酸脅迫組（pH 5.4）和非酸脅迫組的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳和2100生物分析儀進(jìn)行RNA完整性和質(zhì)量檢測。RNA檢測合格后，去除rRNA，通過Oligo磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，加入Fragmentation Buffer通過二價(jià)陽離子將所得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，并進(jìn)行純化。對(duì)純化后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、連接測序接頭、篩選370～420 bp左右片段、PCR擴(kuò)增并純化以獲取文庫。cDNA文庫在Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3.4 差異基因（differentially expressed genes，DEGs）表達(dá)分析

使用每百萬堿基對(duì)測序轉(zhuǎn)錄本序列片段每千堿基片段的預(yù)期數(shù)量（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，F(xiàn)PKM）法計(jì)算組間及樣本間的相關(guān)性系數(shù)，DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|≥1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05[17]。

1.3.5 GO和KEGG富集分析

以進(jìn)行差異顯著分析并注釋到基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫的基因集為背景基因集，差異顯著性分析所得到的DEGs注釋到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集為DEGs集，運(yùn)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析以term為單位，確定DEGs在GO中的分布。KEGG富集分析以pathway為單位，找出DEGs顯著富集的pathway，并進(jìn)一步確定DEGs參與的代謝通路及所發(fā)揮的生物學(xué)作用[18]。

1.3.6 real-time PCR驗(yàn)證相關(guān)DEGs

為了驗(yàn)證RNA-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，選取10個(gè)與耐酸相關(guān)的DEGs，根據(jù)NCBI所公布的鼠傷寒沙門氏菌的基因序列，以16S rRNA為內(nèi)參基因，Oligo 6.0設(shè)計(jì)引物，基因名稱及引物序列見表1。

表1 real-time PCR基因及引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

耐酸能力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件的ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析。熒光定量基因表達(dá)結(jié)果采用Bio-Rad CFX Manager軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析，使用Microsoft Office Excel軟件對(duì)real-time PCR和RNA-seq結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin 2018軟件繪圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的影響

將酸脅迫和非酸脅迫鼠傷寒沙門氏菌在pH 3的強(qiáng)酸條件下進(jìn)行酸激，其存活率如圖1所示，存活率越高，耐酸能力越強(qiáng)。各酸脅迫組的耐酸能力顯著高于非酸脅迫組（P＜0.05），表明鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)酸脅迫后能夠產(chǎn)生ATR，與Lianou[14]和田牧雨[15]等的研究結(jié)果一致。經(jīng)pH 5.4和pH 5.0酸脅迫后的存活率分別為33.33%和36.68%，pH 4.5時(shí)存活率高達(dá)71.72%，顯著高于pH 5.4和pH 5.0（P＜0.05）。鮮切番茄和蘋果的pH值接近4.5[20]，反映了鮮切水果被沙門氏菌污染后其致病風(fēng)險(xiǎn)的增加，為酸性食品實(shí)際生產(chǎn)加工過程中沙門氏菌的防控提供理論基礎(chǔ)。為了在惡劣環(huán)境下存活，鼠傷寒沙門氏菌必須克服許多復(fù)雜的環(huán)境脅迫，其中酸脅迫是一個(gè)重要的影響因素[21]。不同酸脅迫pH值（5.4、5.0和4.5）處理均能夠使鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生ATR，且生鮮牛肉的極限pH值約為5.4，因此選擇pH 5.4的酸脅迫條件開展后續(xù)RNA-seq。

圖1 酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的影響Fig. 1 Effect of acid stress on the acid tolerance response of S. typhimurium

2.2 RNA-seq質(zhì)量評(píng)估及基因組比對(duì)結(jié)果

RNA-seq數(shù)據(jù)中，將酸脅迫組及非酸脅迫組原始序列進(jìn)行過濾剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到過濾后序列為原始序列的97.60%～99.00%，其錯(cuò)配率低于0.03%，Q30比率在93.97%～94.88%之間，GC含量均高于53.60%（表2）。酸脅迫處理組及非脅迫對(duì)照組的測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高，可以進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估Table 2 Quality assessment of sequencing data

2.3 DEGs可視化分析

以|log2FC|≥1且FDR＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。酸脅迫組相對(duì)于非酸脅迫組共篩選683個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因343個(gè)，下調(diào)基因340個(gè)（圖2），從上述結(jié)果中篩選部分耐酸相關(guān)DEGs進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 DEGs分析火山圖Fig. 2 Volcano plot of DEGs

2.4 DEGs GO富集分析

圖3 DEGs GO富集分析Fig. 3 GO enrichment analysis of DEGs

通過Goseq將DEGs注釋到GO數(shù)據(jù)庫，得到DEGs可能具有的功能信息，其中GO包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)維度。如圖3所示，經(jīng)酸脅迫后，DEGs主要富集到生物過程和分子功能。其中生物過程顯著富集到運(yùn)動(dòng)（GO：0040011）、對(duì)外部刺激的反應(yīng)（GO：0009605）、氧化還原過程（GO：0055114）等，分別富集了19、13個(gè)和42個(gè)DEGs。分子功能中顯著富集到氧化還原酶活性（GO：0016491）、輔因子結(jié)合（GO：0048037）等，分別富集到了39個(gè)和29個(gè)DEGs。細(xì)胞組分雖無顯著富集的過程，但有較多DEGs富集到膜蛋白復(fù)合物（GO：0098796）和細(xì)胞質(zhì)（GO：0005737）中。

2.5 DEGs KEGG富集分析

通過pathway顯著性富集得到DEGs參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，圖4為DEGs KEGG富集分析散點(diǎn)圖。與非酸脅迫組相比，經(jīng)酸脅迫后DEGs富集到與全局和總覽途徑相關(guān)的碳代謝（seo01200）、微生物在不同環(huán)境中的代謝（seo01120）和次生代謝產(chǎn)物的生物合成（seo01110）等過程，分別富集到28、53個(gè)和64個(gè)DEGs；與碳水化合物代謝相關(guān)的三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）（seo00020）、磷酸戊糖途徑（seo00030）、糖酵解（seo00010）等途徑，分別富集到10、13個(gè)和8個(gè)DEGs；與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的細(xì)菌趨化（seo02030）和鞭毛組裝（seo02040），分別富集到14個(gè)和18個(gè)DEGs；與氨基酸代謝相關(guān)的谷胱甘肽代謝（seo00480）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（seo00260），分別富集到9個(gè)和10個(gè)DEGs。其他氨基酸代謝如精氨酸和脯氨酸代謝（seo00330）、組氨酸代謝（seo00340）等途徑雖無顯著富集，但仍有較多DEGs表達(dá)上調(diào)。

圖4 DEGs KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of DEGs

2.6 DEGs real-time PCR驗(yàn)證

結(jié)合RNA-seq結(jié)果選取10個(gè)與耐酸相關(guān)的DEGs，以16S rRNA為內(nèi)參基因，對(duì)其進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證。real-time PCR測定結(jié)果與RNA-seq的基因表達(dá)趨勢一致，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.98，驗(yàn)證了RNA-seq結(jié)果的可靠性（圖5）。其中與賴氨酸代謝相關(guān)的cadA、細(xì)胞膜組成相關(guān)的ompC、鞭毛組裝相關(guān)的fliC、細(xì)菌趨化相關(guān)的cheA、交叉保護(hù)相關(guān)的katG和oxyR以及雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)的pmrA表達(dá)上調(diào)，其他耐酸相關(guān)nlpD、rpoS和mgtA表達(dá)下調(diào)，表明鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的產(chǎn)生受到多個(gè)基因多條通路的調(diào)節(jié)。

圖5 real-time PCR和RNA-seq相關(guān)性分析Fig. 5 Correlational analysis between real-time PCR and RNA-seq

2.7 鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的影響機(jī)制

近年來，利用RNA-seq從分子水平上揭示細(xì)菌的耐酸機(jī)制已成為重要的研究方向之一。鼠傷寒沙門氏菌作為備受世界關(guān)注的食源性致病菌，經(jīng)弱酸環(huán)境脅迫后，在致死酸環(huán)境下的存活率顯著升高，這可能是細(xì)菌內(nèi)部抵御應(yīng)激環(huán)境的防御系統(tǒng)表達(dá)所致。為此，本研究根據(jù)RNA-seq相關(guān)DEGs，結(jié)合KEGG pathway富集分析和GO功能注釋分別從氨基酸代謝、細(xì)胞膜組成、細(xì)菌趨化與鞭毛組裝、能量代謝、碳水化合物代謝、交叉保護(hù)和毒力基因的調(diào)控7個(gè)方面系統(tǒng)分析影響酸脅迫鼠傷寒沙門氏菌耐酸能力的相關(guān)機(jī)制（圖6）。

2.7.1 氨基酸代謝系統(tǒng)

鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)酸脅迫后賴氨酸代謝系統(tǒng)被激活，賴氨酸脫羧酶基因cadA和賴氨酸-尸胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cadB表達(dá)上調(diào)，其log2FC分別為2.94和2.97（圖6）。當(dāng)賴氨酸代謝系統(tǒng)激活后，cadA編碼賴氨酸脫羧酶使賴氨酸分解為尸胺同時(shí)消耗1個(gè)質(zhì)子，cadB編碼尸胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將脫羧產(chǎn)物運(yùn)出，維持細(xì)胞穩(wěn)定的pH值。Hu Shuangfang等[22]在大腸桿菌O157:H7中研究表明，cadA和cadB介導(dǎo)的賴氨酸脫羧作用，能夠消耗胞內(nèi)多余的質(zhì)子，保持胞漿穩(wěn)定的pH值，從而提高菌株的耐酸能力。

圖6 鼠傷寒沙門氏菌耐酸機(jī)制Fig. 6 Acid tolerance response mechanism of S. typhimurium

此外，經(jīng)酸脅迫后谷胱甘肽代謝（seo00480）相關(guān)基因的表達(dá)也出現(xiàn)了變化。谷胱甘肽是細(xì)胞活性氧的主要拮抗分子，有兩種存在形式，分別為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），GSH在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶作用下保護(hù)細(xì)胞使其免受氧化損傷[23]。與非酸脅迫組相比，經(jīng)酸脅迫后arcA/B上調(diào)了gor（谷胱甘肽還原酶）和trxB（硫氧還蛋白還原酶）的表達(dá)，其log2FC分別為1.34和0.95（圖6）。這表明鼠傷寒沙門氏菌在酸脅迫過程中經(jīng)歷了氧化損傷，并上調(diào)抗氧化相關(guān)基因修復(fù)酸脅迫造成的細(xì)胞損傷，以促進(jìn)其在酸環(huán)境下的生存能力。Morales等[24]研究表明，鼠傷寒沙門氏菌ΔarcA缺失株經(jīng)H2O2處理后，其gor和trxB酸環(huán)境轉(zhuǎn)錄水平較低，導(dǎo)致二硫鍵形成增加、蛋白質(zhì)失活，抗氧化能力顯著降低，最終造成細(xì)胞死亡。同時(shí)，糖酵解和磷酸戊糖途徑能夠提供NADPH，NADPH也是維持硫氧還蛋白和還原型谷胱甘肽的關(guān)鍵因子[25]。編碼其他氨基酸代謝途徑的基因也受到差異調(diào)節(jié)，特別是脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸，這些代謝途徑的上調(diào)也表明鼠傷寒沙門氏菌在酸脅迫過程中需要大量的營養(yǎng)。

2.7.2 細(xì)胞膜組成

HCl由離子的形式存在，主要通過破壞細(xì)胞膜及胞內(nèi)酶對(duì)細(xì)菌造成傷害[26]。當(dāng)細(xì)胞處于酸性環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞膜的完整性和質(zhì)子動(dòng)力被破壞，細(xì)胞膜功能損傷，導(dǎo)致胞內(nèi)質(zhì)子過多，抑制細(xì)菌生長。此時(shí)鼠傷寒沙門氏菌外膜組分相關(guān)基因ompA、ompC、ompF、ompW和ompX顯著上調(diào)，其log2FC分別為1.86、2.45、1.17、1.15和1.42；內(nèi)膜組分相關(guān)基因yaiY、sfbC、gltK以及其他膜蛋白相關(guān)基因yoaE也呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，其log2FC分別為1.60、1.31、1.42和1.43（圖6）。細(xì)胞膜損傷后，沙門氏菌上調(diào)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)鼠傷寒沙門氏菌的耐酸能力。其他研究也報(bào)道了酸脅迫造成細(xì)胞膜損傷，Bai Hong等[27]研究表明蘋果汁產(chǎn)生的酸性環(huán)境造成細(xì)胞膜損傷后編碼膜蛋白的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，其耐酸能力得到增強(qiáng)；李琳瓊等[28]使用檸檬酸對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行多次酸脅迫后發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜磷脂的相變溫度升高，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，部分膜蛋白表達(dá)量及表達(dá)種類增加，促進(jìn)菌株對(duì)酸環(huán)境的適應(yīng)。

2.7.3 細(xì)菌趨化與鞭毛組裝

當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌感受到酸脅迫后，甲基化受體趨化蛋白相關(guān)基因trg、tcp、cheM、tsr、STM3216和STM3152和Aer傳感器相關(guān)基因aer表達(dá)顯著上調(diào)，其log2FC分別為2.31、2.46、1.84、1.94、1.66、1.33和2.09（圖6）。此時(shí)，趨化相關(guān)基因cheA（log2FC為1.93）識(shí)別到外界酸脅迫，將其磷酸基轉(zhuǎn)移到cheB（log2FC為2.30）或cheY（log2FC為2.22）同源反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，磷酸化的cheY將化學(xué)信號(hào)傳遞至鞭毛馬達(dá)fliM[29]，fliM（log2FC為0.89）進(jìn)一步促進(jìn)鞭毛動(dòng)力相關(guān)的motA（log2FC為0.76）和motB（log2FC為0.72）表達(dá)[30]（圖6）。而有研究表明，當(dāng)單核細(xì)胞性李斯特菌暴露于胃液的強(qiáng)酸環(huán)境下時(shí)，其細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制[31]；阪崎腸桿菌在缺乏氨基酸的M9培養(yǎng)基中生長時(shí)，與鞭毛形成和趨化相關(guān)的基因下調(diào)[32]。這可能是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)需要消耗大量能量[33]，而當(dāng)菌株暴露于極端環(huán)境中時(shí)，鞭毛形成和趨化性等代謝活動(dòng)降低，用以維持菌體的其他必需代謝活動(dòng)，同時(shí)也可能與菌種的不同相關(guān)。

2.7.4 能量代謝調(diào)控

為了適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境，鼠傷寒沙門氏菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（seo02060，phosphortransferase system，PTS）相關(guān)基因呈現(xiàn)不同程度上調(diào)。PTS系統(tǒng)是鼠傷寒沙門氏菌碳水化合物積累的主要機(jī)制之一，經(jīng)酸脅迫后ptsI、ptsH、fruF和fruK等基因表達(dá)上調(diào)，其log2FC分別為0.66、1.10、1.49和1.27。PTS系統(tǒng)包含兩個(gè)胞質(zhì)磷酸轉(zhuǎn)移酶（酶I和組氨酸磷酸載體蛋白）及糖特異性酶II復(fù)合物，其中ptsI編碼酶I、ptsH編碼組氨酸磷酸載體蛋白。當(dāng)磷酸化的酶I將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到組氨酸磷酸載體蛋白上時(shí)，磷酸化的組氨酸磷酸載體蛋白又會(huì)將磷酸基團(tuán)傳遞到細(xì)菌中的糖特異性酶II復(fù)合物中[34]。最終被轉(zhuǎn)運(yùn)的碳水化合物經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)化為糖酵解、磷酸戊糖或TCA途徑的磷酸化中間體，這也使得PTS成為高效的傳感器和快速的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[35-36]。而鼠傷寒沙門氏菌嘧啶代謝（seo00240）中cmk、yeiA以及nrdA等基因表達(dá)下調(diào)，其log2FC分別為-1.45、-1.00和-1.11，這可能是菌體為降低能量消耗，以維持其他必要代謝途徑的方式[37]。

呼吸電子傳遞鏈（GO：0022904）中nuoK和fdoI表達(dá)上調(diào)，其log2FC分別為1.17、0.59，呼吸鏈活性的增加使得NADH氧化生成更多的NAD+，NAD+/NADH比率的提高能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子水平[38]。同時(shí)，經(jīng)酸脅迫后氧化磷酸化（seo00190）相關(guān)亞基表達(dá)上調(diào)，如琥珀酸脫氫酶亞基sdhA（log2FC為1.10）和NADH脫氫酶亞基（nuoN、nuoG、nuoF、nuoK、nuoL、nuoJ，log2FC分別為1.14、1.10、1.18、1.17、1.06和1.20），促進(jìn)了ATP的合成，并消耗了NADH。編碼“物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相結(jié)合”的基因表達(dá)下調(diào)，具體而言，經(jīng)酸脅迫后編碼質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶的相關(guān)基因atpI、rho和atpB顯著下調(diào)，其log2FC分別為-1.75、-1.32和-1.33。當(dāng)ATP合酶相關(guān)基因下調(diào)時(shí)，能夠減少質(zhì)子進(jìn)入菌體內(nèi)部，從而在一定程度上提高鼠傷寒沙門氏菌的耐酸能力。如果ATP合酶再次將H+離子導(dǎo)入細(xì)胞，呼吸鏈將質(zhì)子泵出胞漿的效率將在一定程度上被降低。因此，編碼ATP合酶的基因下調(diào)可以看作是呼吸鏈消耗質(zhì)子，以此提高菌株對(duì)酸環(huán)境的適應(yīng)[31]。

2.7.5 碳水化合物代謝

在本研究中，與非酸脅迫組相比，酸脅迫組中TCA（seo00020）的相關(guān)酶，如蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶和烏頭酸酶編碼基因mdh、icdA、fumC及acnA表達(dá)上調(diào)，其log2FC分別為1.22、0.88、1.47和1.33，促進(jìn)了TCA循環(huán)的進(jìn)行，并在有氧條件下產(chǎn)生大量ATP及NADPH。ribH（log2FC為0.99）和2-氧羧酸代謝通路（seo01210）相關(guān)基因的上調(diào)能夠促進(jìn)乙酰輔酶A的消耗，降低蛋白質(zhì)乙酰化水平，防止酸脅迫下細(xì)胞內(nèi)pH值進(jìn)一步下降[12]。TCA循環(huán)還能為某些氨基酸在內(nèi)的多種化合物提供前體[39]。糖酵解（seo00010）是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸并釋放出能量的過程，經(jīng)酸脅迫后，參與糖酵解途徑的有8個(gè)基因顯著上調(diào)，這表明糖酵解途徑參與了鼠傷寒沙門氏菌酸脅迫的適應(yīng)過程。

2.7.6 交叉保護(hù)反應(yīng)調(diào)控

經(jīng)酸脅迫后，鼠傷寒沙門氏菌在不同環(huán)境中的代謝（seo01120）53個(gè)DEGs表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)細(xì)菌在酸性環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)及DNA都會(huì)受到一定程度的損傷[28]。為了減少損傷，鼠傷寒沙門氏菌會(huì)增加修復(fù)和防御相關(guān)基因的表達(dá)（圖6），如DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)基因recA（log2FC為1.02），保護(hù)大分子使其免受損傷。與耐熱相關(guān)的基因danK、htrA（log2FC分別為1.34和1.02）也表現(xiàn)出一定程度的上調(diào)，dnaK參與蛋白質(zhì)的復(fù)性或分解，并且通過減少錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集和促進(jìn)蛋白質(zhì)水解防止包涵體的形成[40]。另外Spiess等[41]報(bào)道htrA能降低腸炎沙門氏菌面臨高溫環(huán)境時(shí)細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊蛋白的積累及蛋白質(zhì)損傷。因此，鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)酸脅迫后，與高溫抗性相關(guān)基因的上調(diào)為其耐熱性的提高提供了理論支持[42]。oxyR（log2FC為1.06）可以感受氧化脅迫并參與過氧化物代謝和氧化脅迫防御相關(guān)基因（katG和sodA其log2FC分別為2.24和0.98）的調(diào)控，katG負(fù)責(zé)編碼過氧化氫酶，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌在強(qiáng)氧化環(huán)境下的存活至關(guān)重要。

2.7.7 對(duì)毒力基因的影響

外膜蛋白作為一種結(jié)構(gòu)性毒力因子，其相關(guān)基因（詳見2.7.2節(jié)）表達(dá)量的增加會(huì)使細(xì)菌的毒力增強(qiáng)，侵入巨噬細(xì)胞的沙門氏菌還會(huì)形成包含小泡（Salmonellacontaining vacuole，SCV），借助SPI-2產(chǎn)生效應(yīng)蛋白，阻止SCV與溶酶體融合，以此逃避吞噬作用的殺傷[43]。Chowdhury等[44]研究表明，ompA缺失的鼠傷寒沙門氏菌在小鼠巨噬細(xì)胞感染后期激活了宿主巨噬細(xì)胞的自噬，其毒力比野生株明顯降低。鞭毛合成因子（fliC、flgL、flgK、fliK、fliY和fliM，其log2FC分別為2.07、2.11、1.93、2.07、1.49和0.89）表達(dá)上調(diào)除了增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)與趨化能力外，其毒力及黏附入侵能力也顯著提高，以幫助鼠傷寒沙門氏菌定植于食物表面或入侵宿主細(xì)胞，增加對(duì)不利環(huán)境的抵抗能力。Choi等[45]研究表明，阪崎腸桿菌的mcp突變體對(duì)小鼠上皮細(xì)胞的侵襲和黏附能力減弱，在小鼠體內(nèi)的毒力減弱。

PmrA/PmrB組分系統(tǒng)是鼠傷寒沙門氏菌重要的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，pmrA（log2FC為0.96）表達(dá)上調(diào)不僅參與酸環(huán)境的適應(yīng)，還能夠調(diào)控沙門氏菌的毒力，對(duì)脂多糖的修飾有重要作用。脂多糖位于細(xì)胞膜外膜的最表面，主要由類脂A、核心多糖和側(cè)鏈多糖（O抗原）組成，在細(xì)菌定植、入侵宿主細(xì)胞以及抵御巨噬細(xì)胞吞噬作用時(shí)起到重要的自我保護(hù)作用[46]。Hua Jingjing等[47]研究表明，阪崎克羅諾腸桿菌pmrA過表達(dá)促進(jìn)了類脂A的磷酸乙醇胺修飾。在低pH值條件下生長時(shí)，磷酸乙醇胺與類脂A結(jié)合可以增加對(duì)cAMP的抵抗力，并降低宿主固有免疫系統(tǒng)的識(shí)別力和殺傷力[48]。與O抗原生物合成酶相關(guān)的rfb基因簇（rfbB、rfbD、rfbH、rfbU和rfbI，其log2FC分別為-1.61、-1.24、-1.11、-0.90和-0.87）和rfa基因簇（rfaI、rfaG和rfaJ，其log2FC分別為-1.37、-1.77和-1.05）相關(guān)基因的表達(dá)一定程度上下調(diào)。而Bai Hong等[49]研究表明，酸應(yīng)激后腸炎沙門氏菌與毒力相關(guān)的rfa、rfb和rfc基因簇相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，與本研究結(jié)果相反，這可能與不同血清型的菌株相關(guān)，其結(jié)果仍有待進(jìn)一步研究。

鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白和鞭毛相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了菌株的運(yùn)動(dòng)、趨化和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性并增強(qiáng)了毒力，其在酸脅迫下毒力基因高表達(dá)的趨勢，揭示了人們攝入被沙門氏菌污染的含酸食品會(huì)增加其致病性風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié) 論

利用RNA-seq技術(shù)分析了鼠傷寒沙門氏菌酸脅迫后的基因表達(dá)變化。在這683個(gè)DEGs中，其中上調(diào)基因343個(gè)，下調(diào)基因340個(gè)。酸性環(huán)境使得鼠傷寒沙門氏菌胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)子過多，為了平衡多余的質(zhì)子，細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH的比值升高，TCA促進(jìn)乙酰輔酶A的消耗降低蛋白質(zhì)乙酰化水平，同時(shí)降低ATP合酶的活性。鼠傷寒沙門氏菌的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，一些功能基因包括應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)以修復(fù)酸脅迫帶來的損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活。碳水化合物代謝和PTS等產(chǎn)能系統(tǒng)上調(diào)，一些消耗能量的代謝過程下調(diào)，以維持細(xì)胞膜損傷、DNA損傷修復(fù)等必要過程提高鼠傷寒沙門氏菌的耐酸能力。最后，與毒力相關(guān)的鞭毛、外膜蛋白以及雙組分系統(tǒng)等相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)揭示了鼠傷寒沙門氏菌在酸性環(huán)境下致病風(fēng)險(xiǎn)的增加。