漣源市棗樹葉斑病病原菌的鑒定

陽佳媛，林團(tuán)雪，郝亞倫，廖 凱，金晨鐘，2，郭開發(fā)，2

(1 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)藥無害化應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南婁底，417000；2 婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南婁底，417000)

棗樹ZiziphusjujubaMill.在南方適應(yīng)性強(qiáng)，耐貧瘠，抗干旱，產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益好，可作為退耕還林、脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。湖南省棗的種植范圍越來越廣，其中溆浦、衡陽、祁東等地是該省主要的棗種植區(qū)，棗生產(chǎn)在湖南省水果產(chǎn)業(yè)中具有重要的地位[2]。

我國棗樹葉部病害主要報道有交鏈格孢菌Alternariaalternata引起的棗果縮果病和黑斑病[3]，極細(xì)枝孢霉Cladosporiumtenuissimum引起的棗果褐斑病[4]，葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea引起的棗果赤腐病[5]和冬棗輪紋病[6]。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，紅棗葉斑病近年來呈加重趨勢，發(fā)生率達(dá)10%～30%，受害葉片上形成紅褐色圓形或不規(guī)則形、大小不一的斑點(diǎn)，邊緣有黃色暈圈，部分斑點(diǎn)中央色淺，發(fā)生嚴(yán)重時棗樹葉片、幼果早落，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究對湖南省漣源市白馬鎮(zhèn)棗樹葉斑病病原菌進(jìn)行分離和鑒定，以期明確病原菌種類，為制訂病害防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年6月從湖南省漣源市白馬鎮(zhèn)采集棗樹葉斑病病葉10份。病葉典型癥狀：棗葉形成紅褐色圓形或不規(guī)則形、大小不一的斑點(diǎn)，邊緣有黃色暈圈，部分斑點(diǎn)中央色淺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用組織分離法[7]取典型患病棗葉，用75%乙醇擦拭并干燥，于病健交界處切下5 mm×5 mm小塊，在超凈工作臺用1%次氯酸鈉消毒1 min，用無菌水沖洗3次，濾紙干燥后接種到PDA平板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，在WA平板上進(jìn)行單孢純化，將純化后獲得的菌株保存在PDA斜面上，置4 ℃ 冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原物鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定。將病原物在PDA培養(yǎng)基、25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d后，采用壓片法對菌落形態(tài)、色澤、分生孢子的特征進(jìn)行觀察，測量分生孢子的大小等。參照文獻(xiàn)[8]和文獻(xiàn)[9]等資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征鑒定。

分子鑒定。依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，挑選代表菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，采用DNA提取試劑盒提取病原物的DNA，采用引物ITS1/ITS4[10]、Beta-2a/Beta-2b[11]和EF1-983F/EF1-728F進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Easy Taq PCR SuperMix(+dye)25 μL、ITS1/EF1-983F 2 μL、ITS4 /EF1-728F 2 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 20 μL，體積共50 μL。ITS基因序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。延伸因子PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

將不同引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序后的基因序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進(jìn)行同源序列(BLAST)搜索，比較供試菌株與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列同源程度。利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

致病力測定。采集健康無傷、帶有葉片的棗樹枝條，用75%酒精進(jìn)行表面消毒。將試管中的菌種在PDA平板上活化后，用滅菌打孔器(φ=5 mm)在培養(yǎng)菌落上取菌餅，將取好的菌餅接種在PDB液體培養(yǎng)基中，27 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，獲得菌懸浮液，將其放在紫外光下照射2 d，誘導(dǎo)產(chǎn)孢，獲得分生孢子懸浮液，加入無菌水調(diào)整至1×107個孢子/mL。將獲得的分生孢子懸浮液噴灑在刺傷的棗樹枝條的葉片上，以噴灑等量無菌水的棗樹枝條葉片作為對照，每1個代表菌株接種處理設(shè)置3次重復(fù)，將接好的棗樹枝條放在鋪有濕潤滅菌濾紙的保鮮盒中，枝干處用無菌濕潤的脫脂棉包裹，置于25 ℃人工光照氣候箱中培養(yǎng)。每天觀察病斑生長情況，7 d后量取病斑直徑，進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

2021年6月于湖南省漣源市白馬鎮(zhèn)采集帶有典型病斑的棗樹病葉，病斑大部分位于葉片中間，葉片邊緣偶有病斑，病斑圓形或橢圓形，邊緣黑褐色，中央灰白色，外圍有黃色褪綠暈圈(見圖1)。

圖1 葉片自然發(fā)病癥狀

2.2 菌落培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

從發(fā)病葉片上共分離了12個菌株，菌株在PDA培養(yǎng)基上形態(tài)較為一致。從中挑選了5株代表菌株(ZjM2-6-2、ZjM2-3-1、ZjM5-2-3、ZjM5-1-1和ZjM4-1-2)，占總單孢純化菌株的41.7%。菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，初期為白色；接種5 d后，菌落為灰白色，菌絲白色，具有發(fā)達(dá)的氣生菌絲(圖2A)；接種菌株10 d后，菌落變?yōu)楹诤稚?，中央氣生菌絲豐富(圖2B)。經(jīng)近紫外燈照射誘導(dǎo)產(chǎn)孢后，觀察到其分生孢子，分生孢子呈梭形，光滑，無隔膜，平均大小為 (15.0～20.0)μm×(4.5～6.5)μm(圖2C)。

A：培養(yǎng)5 d 后的菌落；B：培養(yǎng)10 d 后的菌落；C：分生孢子

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以5株代表菌株的基因組DNA為模板，對其28SrDNA-ITS、EF-1α基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其ITS和引物因子擴(kuò)增條帶大小分別為 560 bp和1 230 bp?；贗TS測出的序列提交至Genbank，獲得的基因登錄號分別為MZ558056、MZ558057、MZ558058、MZ558059和MZ558060。將代表菌株ZjM2-6-2序列與相關(guān)序列在MEGA7.0中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株ZjM2-6-2與葡萄座腔菌B.dothidea的MH393518.1、LC168758.1、KF293945.1和EU520229.1在同一分支，且與葡萄座腔菌B.dothidea序列同源性為100%(見圖3)。

圖3 代表菌株基于ITS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病菌致病性測定

在室內(nèi)條件下，采用離體接種處理，將代表性菌株ZjM2-6-2和其他分離菌株的分生孢子懸浮液分別接種在健康棗樹枝條的刺傷葉片上，并設(shè)置無菌水接種作為對照，置于保鮮盒中的濕潤無菌濾紙上，用無菌濕潤脫脂棉包裹枝干。結(jié)果顯示，接種5 d后，對照的葉片未發(fā)病，刺傷接種病原菌的葉片觀察到病害癥狀，病斑直徑約6 mm，圓形或橢圓形，邊緣紅褐色，病斑周圍有一圈黃色褪綠暈圈，中央黃白色。這些癥狀與自然條件下的棗樹葉斑病癥狀基本相似(見圖4)。將接種發(fā)病的葉片再次采用組織分離法進(jìn)行菌株分離，采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA-ITS、EF-1α序列分析，鑒定出該病原菌為葡萄座腔菌。

圖4 代表性菌株致病性試驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

B.dothidea是葡萄座腔菌屬中最常見的種類，寄主范圍廣，可使20科34屬50余種植物致病。B.dothidea屬于弱寄生菌，能引起葉斑、枝梢枯萎、枝干潰瘍、果實(shí)腐爛等多種果樹病害癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12-14]。已有文獻(xiàn)報道，B.dothidea可引起櫻桃葉斑病[15]、棗樹干腐病[16]、冬棗輪紋病[17]和黃桃爛果病[18]等，而葡萄座腔菌可以引起厚葉南五味子[19]、中華常春藤[20]和桂花[21]等植物的葉斑病。

有關(guān)棗樹葉斑病的病原物的研究報道較少，不同地區(qū)葉斑病的致病病原菌不一致。已有文獻(xiàn)報道，新疆地區(qū)的紅棗葉斑病通過致病性測定、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，將其病原菌鑒定為交鏈格孢菌Alternaria.alternata(Fries) Keissle[22]；寧夏地區(qū)的棗樹葉斑病病原菌有半知菌亞門真菌中的棗葉橄欖色盾殼霉Conithyriumaleuritis和棗葉斑點(diǎn)盾殼霉Coniothyrium.fuckelii[23]。通過此次對棗樹葉斑病的病原菌進(jìn)行鑒定，可以為湖南省漣源市棗樹葉斑病的防治提供一定的理論依據(jù)，也可為相似氣候和地形條件下的棗樹葉斑病的防治提供一定的參考價值。

本研究從湖南省漣源市白馬鎮(zhèn)棗樹葉片上分離獲得病原菌5株，對其進(jìn)行培養(yǎng)性狀觀察、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病原菌與葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea基本一致，rDNA-ITS和EF-1α兩個基因序列與葡萄座腔菌的序列的同源性為100%，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時也與葡萄座腔菌聚在同一分支上。結(jié)合致病性試驗(yàn)，可將該病原物鑒定為葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea。