貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病病原菌分離鑒定及防治藥劑毒力測(cè)定

羋婷婷，瞿光凡，王小崗，孫雁征，雷霽卿，巴良杰，曹 森

(貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴陽(yáng)，550005)

獼猴桃Actinidiachinensis因含有大量維生素C、葉酸等營(yíng)養(yǎng)成分，果實(shí)酸甜可口，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[1-4]。近年來(lái)，隨著獼猴桃種植面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐漸上升，但獼猴桃病害卻不斷加重，影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展[5]。目前，大多數(shù)學(xué)者主要集中研究獼猴桃軟腐病的病原菌分離鑒定及防治[6]，而蒂腐病已逐漸出現(xiàn)在獼猴桃主產(chǎn)區(qū)，但關(guān)于獼猴桃蒂腐病的研究相關(guān)的報(bào)道還比較少。因此，分析獼猴桃蒂腐病病原菌，篩選有效的殺菌劑，對(duì)獼猴桃蒂腐病的防控具有重要意義。

化學(xué)殺菌劑是防治獼猴桃病害[7]的有效手段之一。裴艷剛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲對(duì)獼猴桃灰霉病均有較好的防治效果；張凱東等[9]報(bào)道了17種殺菌劑對(duì)獼猴桃葉斑病病原菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其中50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、50%苯甲丙環(huán)唑乳油、40%氟硅唑和50%氟啶胺懸浮劑具有強(qiáng)毒力作用；吳文能等[10]研究表明，75%肟菌酯戊唑醇、30%己唑醇、43%戊唑醇和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)F長(zhǎng)獼猴桃軟腐病具有較好的控制效果。本研究基于貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病的病原菌分離，結(jié)合形態(tài)特征及ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并采用6種化學(xué)殺菌劑對(duì)病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)試，以期為貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴長(zhǎng)獼猴桃采摘于貴州省修文縣獼猴桃試驗(yàn)基地；PDA培養(yǎng)基，上海博微生物科技有限公司生產(chǎn)；70%甲基硫菌靈，允發(fā)化工上海有限公司生產(chǎn)；43%戊唑醇，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；45%咪鮮胺，蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司生產(chǎn)；50%多菌靈，四川稼得利科技開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)；50%異菌脲，蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司生產(chǎn)；10%苯醚甲環(huán)唑，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)。

儀器與設(shè)備主要有：超凈工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯公司生產(chǎn)；ChemiDoc免染型蛋白印跡成像系統(tǒng)，成都百樂(lè)科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化

采用組織分離法[11]對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病病原菌進(jìn)行分離。將自然發(fā)病的獼猴桃用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次后置于超凈工作臺(tái)中自然晾干，用滅菌解剖刀切取病健交界處組織接在PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落形成后挑取菌落邊緣菌絲于新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3～5次劃線分離，獲得純化菌株。

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定

依據(jù)科赫法則[12]對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。挑選健康的貴長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)，用75%醫(yī)用酒精擦拭果面進(jìn)行消毒，在健康果實(shí)果蒂處打孔，采用針刺法將病原菌菌餅接種到傷口處，以無(wú)菌菌餅作為對(duì)照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待果實(shí)發(fā)病后再次分離培養(yǎng)病原菌，并根據(jù)形態(tài)特征與原接種菌株進(jìn)行比較，如果一致則確定為該病原菌。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定，挑取已純化的病原菌的菌絲，接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至接近培養(yǎng)皿壁，觀察各致病菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征。挑取少量菌絲于載玻片上，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、分生孢子特征等，進(jìn)行病原菌初步鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～5 d 后，參照植物基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，刮去菌絲體，利用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(生工有限公司，貴陽(yáng))提取病原菌基因組。以提取的基因組DNA為模板，應(yīng)用通用引物ITS1(5′—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3′)和ITS4(5′—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3′)進(jìn)行擴(kuò)增。引物擴(kuò)增體系為：2×Taq PCR Master Mix15 μL，DNA 1 μL，10 mmol/L上游引物1 μL與10 mmol/L下游引物1 μL，超純水12 μL。PCR 循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 修復(fù)延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳成像檢測(cè)。利用 Master Mix進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送樣測(cè)序(生工有限公司，貴陽(yáng))，序列結(jié)果與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)，并選擇同源性相近的物種結(jié)合MEGA 7軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13]，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.3 抑菌藥物篩選

本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法[14-15]對(duì)供試藥劑的體積質(zhì)量先進(jìn)行初步篩選，在進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各供試藥劑的最低抑制體積質(zhì)量(見(jiàn)表1)，配制5個(gè)體積質(zhì)量梯度的PDA培養(yǎng)基平板，以無(wú)菌水為對(duì)照(CK)。將蒂腐病菌株置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后用滅菌打孔器取直徑為5 mm的邊緣菌絲塊，分別接種到各含藥培養(yǎng)基中央，重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值計(jì)算出菌絲生長(zhǎng)速率，以藥劑質(zhì)量密度對(duì)數(shù)為自變量，抑菌率對(duì)應(yīng)的概率值為因變量，求出毒力方程。

表1 不同供試殺菌劑的體積質(zhì)量

生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.5)×100，0.5為滅菌打孔器取的菌絲塊的直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 2010軟件以體積質(zhì)量對(duì)數(shù)為自變量(x)、概率值為因變量(y)，求得回歸方程y=ax+b，并計(jì)算出相關(guān)系數(shù)(r)與有效抑制質(zhì)量密度(EC50值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)病癥狀

貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病癥狀如圖1。果蒂處冒出白色絨毛狀菌絲，其菌落在獼猴桃果蒂處呈圓形，較平坦，白色霉?fàn)钗?，并逐漸向外擴(kuò)散，果蒂周?chē)饰锠?圖1A)；果蒂處的果肉伴有軟爛，腐爛部分果肉向外延伸至全果，腐爛果肉有少量水漬，果肉呈現(xiàn)暗綠色，有透明感(圖1B)，伴有酒精的氣味。

A：感病獼猴桃的外觀；B：感病獼猴桃的果肉

2.2 病原菌形態(tài)特征

本研究從自然腐爛的貴長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)中分離出2株病原菌，記作GC-1和GC-2(見(jiàn)圖2)。GC-1的菌落起初生長(zhǎng)狀況良好，為白色絨毛狀，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d后，從菌落中央冒出白色漸層(圖2A)，有向四周擴(kuò)散的趨勢(shì)。菌落呈圓形，較平坦，光滑有光澤，呈半透明，質(zhì)地干燥易挑起，菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)濃密，有棉絮狀，隆起狀態(tài)較為扁平(見(jiàn)圖2B)。經(jīng)顯微鏡觀察的分生孢子單孢，表面光滑，為鐮刀型或紡錘型，有較多的橫隔(見(jiàn)圖2C)。依據(jù)病菌形態(tài)特征，初步將其鑒定為木賊鐮刀菌Fusariumequiseti。

GC-2菌株菌落較大，外觀呈圓形或卵圓形，乳白色絨毛狀，菌落表面光滑有光澤，不透明，菌落邊緣呈鋸齒形，不平整，菌絲致密，菌落質(zhì)地濕潤(rùn)有黏稠感(圖2D、E)。經(jīng)顯微鏡觀察分生孢子為卵圓形，分生孢子梗直立、細(xì)長(zhǎng)，不分隔、無(wú)分支；分生孢子頂生成團(tuán)，以下側(cè)方連接于孢子梗，基部有小突起，無(wú)色，雙胞，分隔處略縊縮，長(zhǎng)圓至梨形(圖2F)。初步鑒定為粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea。

A、B分別為GC-1菌落的正、反面；C為GC-1的分生孢子；D、E分別為GC-2菌落的正、反面；F為GC-2的分生孢子

2.3 病原菌致病性測(cè)定

將分離純化的兩株病原菌回接到健康果實(shí)上，以接無(wú)菌菌餅為對(duì)照組，室溫放置7 d后，其發(fā)病情況如圖3所示。對(duì)照組(圖3A、圖3B)均無(wú)發(fā)病。接種菌株GC-1的獼猴桃果蒂處長(zhǎng)出大量的白色絨毛狀菌絲，其菌落在獼猴桃果蒂處呈圓形，較平坦，光滑有光澤，質(zhì)地干燥易挑起，氣生菌絲發(fā)達(dá)。獼猴桃果蒂周?chē)庖舶橛熊洜€，腐爛部分果肉向外延伸至全果，腐爛果肉呈少量水漬狀，果肉呈現(xiàn)淺黃色，有透明感(見(jiàn)圖3C、圖3D)，并伴有酒精的氣味。接種菌株GC-2的獼猴桃果蒂處有大量的白色菌絲，菌絲致密黏稠，其周?chē)ど仙鼍鶆虻囊粚踊野咨範(fàn)钗?圖3E)，最終為灰霉，并于灰霉上生大量褐色分生孢子梗，或與菌絲體交織一起，形成不規(guī)則形扁平黑色小菌核，緊貼于果實(shí)上，呈灰色。果肉呈現(xiàn)深褐色，有水漬狀軟化腐爛現(xiàn)象(圖3F)。對(duì)發(fā)病的病原菌重新分離再培養(yǎng)，其特性和菌絲形態(tài)與原先的病原菌一致。

A、B為對(duì)照；C、D為接種GC-1后的獼猴桃；E、F為接種GC-2后的獼猴桃

2.4 病原菌的分子鑒定

運(yùn)用CTAB提取法提取以上兩種真菌的DNA，以通用引物ITS1(5′—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3′)和 ITS4(5′—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳成像檢測(cè)，得到GC-1和GC-2 菌株的rDNA-ITS序列。電泳圖譜顯示兩個(gè)菌株的rDNA-ITS 序列長(zhǎng)度為500～700 bp(見(jiàn)圖4)。將PCR產(chǎn)物寄送至貴陽(yáng)生工公司測(cè)序，將菌株序列提交至BLAST網(wǎng)站進(jìn)行同源性比較，下載同源性較高序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，如圖5所示，發(fā)現(xiàn)GC-1、GC-2與木賊鐮刀菌和粉紅螺旋聚孢霉的同源性分別達(dá)99%和100%，并結(jié)合形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)特性，確定GC-1、GC-2病原菌分別為木賊鐮刀菌Fusariumequiseti和粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea。

圖4 GC-1、GC-2的電泳圖譜

圖5 獼猴桃蒂腐病病原菌GC-1、GC-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 6種殺菌劑對(duì)蒂腐病菌的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果看出，甲基硫菌靈對(duì)GC-1的抑菌效果最好，EC50值為8.200 7 mg/L；異菌脲和咪鮮胺對(duì)GC-1的抑菌效果較好，EC50值分別為19.643 1、23.245 4 mg/L；多菌靈和戊唑醇對(duì)GC-1的抑菌效果明顯，EC50值分別為37.750 5、70.253 3 mg/L；苯醚甲環(huán)唑?qū)C-1的抑菌效果相對(duì)較差，EC50值為139.217 9 mg/L。從6種殺菌劑對(duì)GC-2的抑菌效果來(lái)看，多菌靈對(duì)GC-2的抑菌效果最好，EC50值為7.854 0 mg/L；咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)C-2的抑菌效果較好，EC50值分別為14.370 3、28.161 5 mg/L；甲基硫菌靈、異菌脲和戊唑醇對(duì)GC-2的抑菌效果相對(duì)較差，EC50值分別為100.795 3、126.379 7和135.900 8 mg/L(見(jiàn)表2、表3)。

表2 6種殺菌劑對(duì)獼猴桃蒂腐病菌GC-1的毒力測(cè)定

表3 6種殺菌劑對(duì)獼猴桃蒂腐病菌GC-2的毒力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

木賊鐮刀菌Fusariumequiseti和粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea是寄主范圍較廣的病原真菌，能夠侵染果實(shí)和蔬菜，從而導(dǎo)致果蔬失去商品價(jià)值[16-17]。本文通過(guò)病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定表明，引起貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病的病原菌為木賊鐮刀菌和粉紅螺旋聚孢霉。

化學(xué)藥劑防治是有效控制果蔬病害的重要手段[18-20]。成世杰等[21]研究結(jié)果表明，甲基硫菌靈對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的EC50值為0.700 8～0.814 5 mg/L，平均為(3.357 9±0.160 7)mg/L，說(shuō)明田間蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)甲基硫菌靈較敏感。王會(huì)會(huì)等[22]研究結(jié)果顯示，40%氟硅唑乳油、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、50%多菌靈可濕性粉劑和12.5%烯唑醇乳油對(duì)火龍果潰瘍病病原菌新暗色柱節(jié)孢的抑菌效果最好，EC50值分別為0.050 7、0.131 7、0.183 2和0.173 1 mg/L。李誠(chéng)等[23]研究發(fā)現(xiàn)，75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒劑、50%異菌脲懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、60%吡唑醚菌酯·代森聯(lián)水分散粒劑等5種殺菌劑對(duì)葡萄座腔菌和擬莖點(diǎn)霉菌均有較強(qiáng)的毒力，對(duì)葡萄座腔菌的EC50值依次為0.143 9、0.150 2、0.179 5、0.264 0和0.946 6 μg/mL，對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌的EC50值依次為0.089 3、0.222 8、0.132 0、0.403 4和0.792 2 μg/mL。此外，翟慧者等[24]還發(fā)現(xiàn)，在抑菌試驗(yàn)中，抑菌作用最強(qiáng)的藥劑是甲基硫菌靈(山西北方種業(yè))和腐植酸·銅，抑菌帶均為5.00 cm，其次為菌毒清、丙環(huán)唑和甲硫·萘乙酸。本文采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了6種殺菌劑(70%甲基硫菌靈、43%戊唑醇、45%咪鮮胺、50%多菌靈、50%異菌脲和10%苯醚甲環(huán)唑)對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃蒂腐病病原菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明，甲基硫菌靈對(duì)GC-1的抑菌效果最好，其次是異菌脲、咪鮮胺、多菌靈和戊唑醇，苯醚甲環(huán)唑抑菌效果最差；多菌靈對(duì)GC-2的抑菌效果最好，其次是咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑，甲基硫菌靈、異菌脲和戊唑醇的抑菌效果最差。這與前人報(bào)道甲基硫菌靈和多菌靈具有明顯抑菌效果一致。但本研究只是在室內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，僅驗(yàn)證了甲基硫菌靈和多菌靈在試驗(yàn)條件下分別對(duì)木賊鐮刀菌和粉紅螺旋聚孢霉有較強(qiáng)的抑菌作用，其田間防控效果有待進(jìn)一步研究。