油梨枝干潰瘍病新病原菌鑒定及生物學(xué)特性

張 賀，劉遠(yuǎn)征，何 昊，李艷霞，馬蔚紅，王甲水

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站，?？?，571101；2 湖南文理學(xué)院，湖南常德，415000)

油梨PerseaamericanaMill.，又稱鱷梨、牛油果、樟梨、酪梨，是樟科鱷梨屬常綠喬木，原產(chǎn)于墨西哥、中美洲濕潤地區(qū)[1]。我國自1918年引進(jìn)種植，現(xiàn)海南、云南、廣西、廣東、福建、四川及臺灣等熱帶亞熱帶地區(qū)均有種植[2]。油梨營養(yǎng)價(jià)值較高，富含不飽和脂肪酸、維生素、礦質(zhì)元素等，在營養(yǎng)保健、抗衰老、美容護(hù)膚等方面均有應(yīng)用價(jià)值。油梨還具有經(jīng)濟(jì)效益高、市場潛力大、種植管理簡單等優(yōu)勢[3]。近年來，我國油梨種植規(guī)模迅速擴(kuò)大。

目前，已報(bào)道的油梨莖部病害主要有由新殼梭孢屬(Neofusicoccumsp.)、小穴殼屬(Dothiorellasp.)引起的油梨枝干潰瘍病[4]，擬盤多毛孢屬真菌(Pestalotiopsissp.)引起的梢枯病[5]，南方靈芝Ganodermaaustrale(Fr.) Pat.引起的油梨莖腐病等[6]。國內(nèi)已報(bào)道的油梨真菌病害還有樟疫霉菌Phytophththoracinnamomi、焦菌屬(Ustulinasp.)、蜜環(huán)菌Armillariellamellea、假蜜環(huán)菌Armillariatabescens和絲核菌(Rhizoctoniasp.)等病菌引起的油梨根腐病等[7-8]。當(dāng)前，尚未見由假可可毛色二孢Lasiodiplodiapseudotheobromae引起油梨枝干潰瘍病的相關(guān)報(bào)道。本研究從海南省儋州市油梨種植園油梨樹上發(fā)現(xiàn)大量呈潰瘍、壞死癥狀的枝條，嚴(yán)重影響樹體樹勢，通過采集發(fā)病枝條、病原菌組織分離純化、種類鑒定、致病力測定及生物學(xué)特性分析等研究，以期為油梨枝干潰瘍病的病原診斷、流行規(guī)律分析、致病機(jī)理挖掘以及病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年10月，在海南省儋州市油梨種植園發(fā)病油梨樹上采集病枝，用于病原菌分離。供試油梨品種為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站油梨種質(zhì)資源圃內(nèi)種植的4年生油梨植株，分別為“巴康”“祖坦諾”“桂研10號”“哈斯”“桂墾大2號”“富爾特”等 6個品種。

供試培養(yǎng)基：PDA、PCA、CMA、OMA、CA、V8、PSA參考《植病研究方法》[9]配制。真菌DNA提取試劑盒購自美國OMEGA Bio-tek公司，Premix TaqTM、Goldview和DL2000 DNA Marker購自日本TaKaRa Bio公司。設(shè)備包括研究級萬能數(shù)碼熒光正置顯微鏡Imager A2，德國卡爾蔡司股份公司產(chǎn)；PCR儀Tpersonal 48，德國耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)；電泳儀DYY-8C，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)Azure C150，美國Azure Biosystems產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采用組織分離法[10]，用滅菌解刨刀從發(fā)病枝條病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，放入次氯酸鈉溶液中消毒1 min，用滅菌超純水連續(xù)沖洗3次，放在滅菌濾紙片上干燥。將組織塊放入PDA平板中培養(yǎng)3 d，挑取菌落尖端的菌絲進(jìn)行純化。分離菌株培養(yǎng)3周左右產(chǎn)生分生孢子，采用單孢分離法進(jìn)一步純化。從14個生長完全一致的分離菌株中選擇1株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，編號為DZ01。

1.2.2 柯赫氏法則回接試驗(yàn) 挑取菌株DZ01菌落邊緣的菌絲活化培養(yǎng)3 d，用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打孔獲取菌餅，用于接種實(shí)驗(yàn)。從儋州市試驗(yàn)場紅洋隊(duì)油梨園采集生長健康、大小一致的“哈斯”油梨當(dāng)年生枝條，剪成長度20 cm的枝段，70%酒精消毒10 s，無菌水沖洗3次后備用。在備用枝條葉間部位針刺4次造成菱形傷口，將菌餅接種至傷口部位，以傷口接種無菌PDA作為對照。接種后的枝條放入鋪有濕紗布的塑料框中，保鮮膜密封保濕；置于光照培養(yǎng)箱中，28 ℃，12 h光照/12 h黑暗，相對濕度90%培養(yǎng)。每個處理接種枝條10條，重復(fù)3次。每天觀察發(fā)病情況，當(dāng)油梨枝條出現(xiàn)典型發(fā)病癥狀時(shí)，采用1.2.1方法從發(fā)病枝條中再次分離病原菌。

1.2.3 菌株鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株DZ01接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)36 h，觀察菌落形態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)14～21 d，菌落中產(chǎn)生分生孢子器，在正置光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征，測量分生孢子長寬，根據(jù)形態(tài)特征對菌株DZ01進(jìn)行初步鑒定。

分子鑒定：將菌株DZ01接種到鋪有玻璃紙的PDA平板上培養(yǎng)7 d，用滅菌手術(shù)刀刮取菌絲，使用OMEGA真菌DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA，采用ITS、EF1-α的引物序列(見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，將獲得的序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對，并提交序列至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號；在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載同源性高的序列。使用SequenceMatrix軟件進(jìn)行ITS和EF1-α序列片段的拼接，再使用MEGA 6.0[11]軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。

表1 多基因序列引物

1.2.4 不同油梨品種的抗性測定 采用離體接種法評價(jià)“巴康”“祖坦諾”“桂研10號”“哈斯”“桂墾大2號”“富爾特”等6個油梨品種對枝干潰瘍病的抗性。使用病原菌菌株DZ01分別接種不同品種枝條，接種方法同1.2.2，接種后每天測量病斑大小，記錄并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性測定 不同培養(yǎng)基的影響：選用PDA、PCA、CMA、OMA、CA、V8、PSA等培養(yǎng)基平板，將活化培養(yǎng)2 d的病原菌菌餅(直徑5 mm)接種到平板中央，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每處理重復(fù)4次，使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同pH值的影響：將滅菌PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，使用過濾除菌的1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至2～11，將活化培養(yǎng)2 d的病原菌菌餅接種到平板中央，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，每處理重復(fù)4次，使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同碳源的影響：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、山梨醇、可溶性淀粉30 g作為碳源替換蔗糖，配制不同碳源培養(yǎng)基，將活化培養(yǎng)2 d的病原菌菌餅接種到平板中央，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，每處理重復(fù)4次，使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同氮源的影響：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用硝酸鉀、硝酸銨、酵母粉、甘氨酸3 g作為氮源替硝酸鉀，配制不同氮源培養(yǎng)基，將活化培養(yǎng)2 d的病原菌菌餅接種到平板中央，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，每處理重復(fù)4次，使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同光照的影響：將活化培養(yǎng)2 d的病原菌菌餅接種到PDA平板中央，分別設(shè)置24 h光照、24 h黑暗和12 h光照+12 h黑暗處理，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，每處理重復(fù)4次，使用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 9.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用SAS 8.1軟件的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油梨枝干潰瘍病癥狀

油梨枝條發(fā)病初期呈水浸狀病斑，后期病斑暗褐色或黑褐色；病斑橢圓形或不規(guī)則形，侵染初期病斑較小，隨侵染時(shí)間延長不斷擴(kuò)大，部分病斑組織連接成片，表面凹陷，表皮開裂，皮層內(nèi)韌皮組織潰瘍；嚴(yán)重時(shí)整個枝條枯死，導(dǎo)致樹勢衰弱，甚至整株死亡。此外，病原菌還可侵染枝條皮孔，導(dǎo)致皮孔開裂，在枝條表皮形成顆粒狀突起(見圖1)。

2.2 病菌回接

接種分離菌株DZ01 1 d后，枝條表面出現(xiàn)水漬狀橢圓形病斑；接種3 d后，油梨枝條病斑黑褐色，表面出現(xiàn)凹陷，呈典型的潰瘍癥狀；而對照無癥狀(見圖1)。枝條發(fā)病部位病健交界處分離獲得的病原菌菌株與接種菌株DZ01菌落形態(tài)特征相同，從而確定菌株DZ01是引起油梨枝干潰瘍病的病原菌。

圖1 油梨枝干潰瘍病癥狀及菌株DZ01接種油梨枝條的致病性

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定 接種菌株DZ01于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)36 h即可長滿直徑9 mm的PDA平板。菌落初期白色，絨毛狀，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣整齊；培養(yǎng)7 d后，菌落出現(xiàn)黑色素沉淀，灰色至灰黑色；培養(yǎng)15～21 d時(shí)，菌絲體表面產(chǎn)生灰黑色的分生孢子器，近球形或球形，單生或聚生，具孔口，孔口開裂時(shí)溢出黑色或無色液體。分生孢子無色透明，橢圓形，頂端和基部圓形，中間最寬，壁厚；老熟時(shí)變成含1個分隔的深褐色分生孢子(見圖2)。分生孢子大小為(18.0～26.4) μm×(12.3～14.1) μm(n=50)，平均23.0 μm×13.5 μm，分生孢子長寬比為1.7。參照Phillips等[14]的分類和描述，該菌株DZ01初步鑒定為毛色二孢屬真菌(Lasiodiplodiasp.)

注：箭頭示分生孢子器。

2.3.2 分子鑒定 測序后獲得菌株DZ01的ITS序列為523 bp(登錄號：MZ452371.1)，EF1-α序列為307 bp(登錄號：MZ467414.1)，將上述序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果顯示，該病原菌的ITS序列與Lasiodiplodiapseudotheobromae(登錄號：MK529970.1)的同源性達(dá)99.81%，EF1-α序列與L.pseudotheobromae(登錄號：MK562455.1)的同源性達(dá)99.32%。將2種基因的序列拼接，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)基因序列(見表2)，聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，分離菌株DZ01與L.pseudotheobromae聚在一起，形成1個明顯的分枝，而與Lasiodiplodia屬的其他種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(見圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定油梨枝干潰瘍病病原菌為可可毛色二孢Lasiodiplodiapseudotheobromae。

表2 不同病菌相關(guān)基因序列登錄號

圖3 油梨枝干潰瘍病病原菌ITS-EF1-α的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 不同油梨品種的抗性

菌株DZ01離體接種6個油梨品種發(fā)現(xiàn)，供試油梨品種均能感病，接種3 d時(shí)病斑長度6.8～26.9 mm。其中“富爾特”最感病，病斑擴(kuò)展迅速，接種3 d時(shí)病斑長度達(dá)到26.9 mm，顯著高于其他品種；“哈斯”“巴康”“桂墾大2號”“桂研10號”中等感病，接種3 d時(shí)病斑長度8.5～14.8 mm；“祖坦諾”最耐病，病斑長度顯著低于其他品種，為6.8 mm(見表3)。

2.5 不同光照條件的影響

不同光照條件下，DZ01菌株的菌絲生長一致，菌落直徑差異不顯著，表明不同光照條件對病原菌菌絲生長無顯著性影響(見表3)。

表3 不同油梨品種對枝干潰瘍病病原菌抗性比較及不同光照下該病原菌菌落生長比較

2.6 不同培養(yǎng)基、pH值、碳源或氮源的影響

不同培養(yǎng)條件對油梨枝干潰瘍病病原菌菌落生長的影響不同。該病原菌在PCA培養(yǎng)基中生長迅速，菌落直徑最大，PCA為最適培養(yǎng)基；OMA培養(yǎng)基上菌落直徑最小。不同pH值對菌株DZ01菌絲生長的影響差異顯著(p<0.05)。pH值3～10該病原菌均可生長，pH值2、11病原菌不生長；pH值3～4時(shí)，病原菌菌落直徑逐漸增大；當(dāng)pH值4～11時(shí)，病原菌的菌落直徑則逐漸變小。該病原菌的最適pH值為4，適合在偏酸條件下生長。病原菌在供試碳源和氮源的Czapek上均可生長，但利用程度不同。以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上，病原菌菌落直徑最大，蔗糖為最佳碳源。病原菌在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快，酵母粉為最適氮源(見表4)。

表4 不同培養(yǎng)基、pH值、碳源或氮源對油梨枝干潰瘍病病原菌菌落生長的影響

3 結(jié)論與討論

對海南省儋州市油梨園枝干潰瘍病病原菌進(jìn)行分離鑒定和致病性分析表明，該病害是由Lasiodiplodiapseudotheobromae侵染引起的，這是該病原菌導(dǎo)致油梨枝干潰瘍病的首次發(fā)現(xiàn)。研究表明，多種病原菌可侵染油梨引起枝干潰瘍病，包括Neofusicoccumaustrale、N.luteum、N.parvum、N.nonquaesitum、Fusicoccumaesculi、Dothiorellaiberica、Phytophthoracitricola等[15-17]。這些病原菌可侵染油梨主干、分枝及當(dāng)年生枝條，形成深褐色壞死病斑。本研究發(fā)現(xiàn)，L.pseudotheobromae主要為害油梨分枝和當(dāng)年生枝條。

L.pseudotheobromae寄主范圍較廣，是一類重要的植物內(nèi)生菌和病原真菌。Correia等報(bào)道L.pseudotheobromae可引起葡萄枝干潰瘍病[18]，導(dǎo)致主干和枝條產(chǎn)生壞死性褐色斑點(diǎn)、皮部開裂等癥狀，與本研究的病害癥狀表現(xiàn)相似。此外，該病原菌侵染也可導(dǎo)致蘋果枝干潰瘍病[19]、馬占相思枝干潰瘍病[20]、樸樹枝干潰瘍病[21]等。品種抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，“富爾特”“哈斯”等油梨品種對枝干潰瘍病的抗性較弱，對于種植“富爾特”“哈斯”等品種的園區(qū)，需高度重視，做好防控。而“祖坦諾”對枝干潰瘍病抗性較強(qiáng)，可作為候選抗性品種進(jìn)一步評估。

生物學(xué)特性研究表明，油梨枝干潰瘍病病原菌的最適培養(yǎng)基為PCA；適宜pH值范圍較廣，pH值4時(shí)菌絲生長最快；最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母粉；不同光照條件對菌絲生長速率無顯著性影響。本研究對于油梨枝干潰瘍病病原菌的鑒定和防治具有指導(dǎo)意義，也為進(jìn)一步開展病原診斷、病原菌發(fā)病規(guī)律探究以及藥劑篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。