百香果莖基腐病病原鑒定及室內(nèi)毒力測(cè)定

陳 圓，趙志祥，嚴(yán)婉榮，王海洪，吉訓(xùn)聰

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究中心/海南省植物病蟲(chóng)害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?？谧魑镉泻ι锟茖W(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，?？冢?71100)

百香果又名雞蛋果、西番蓮，是一種熱帶水果，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有“飲料之王”的美稱[1]。近年來(lái)，隨著百香果種植面積不斷擴(kuò)大，未經(jīng)檢疫或消毒的苗木大量進(jìn)入市場(chǎng)，百香果病害發(fā)生越來(lái)越多，主要有莖基腐病和病毒病。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，莖基腐病的發(fā)病率為14%，致死率為5%[2]，是一種毀滅性病害。據(jù)研究報(bào)道，引起百香果莖基腐病的病原有多種，包括腐皮鐮孢菌Fusariumsolani(Mart) Sacc[2-4]、尖孢鐮刀菌F.oxysporumSchlecht[5]、疫霉菌PhytophthoranicotianaeBreda de Haan[6]、輪紋鐮刀菌F.concentricum[7]，毛色二孢屬(Lasiodiplodia)、黑孢屬(Nigrospora)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、新擬盤多毛孢屬(Neopestalotiopsis)、假擬盤多毛孢屬(Pseudopestalotiopsis)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)和漆斑菌屬(Myrothecium)等病菌[8]。宋曉兵等[3]結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定及rDNA ITS序列分析，鑒定廣東省西番蓮莖基腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌F.solani。鄭加協(xié)等[5]研究認(rèn)為西番蓮莖基腐病的病原為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。詹儒林等[6]從海南省瓊海市西番蓮上分離出莖基腐病原物，鑒定為疫霉菌P.nicotianae。然而，引起海南西番蓮莖基腐病的病原是否有其他種真菌，或多個(gè)種真菌復(fù)合侵染，目前鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

百香果莖基腐病的藥劑防治研究發(fā)現(xiàn)，65%代森鋅和80%多菌靈田間防效較好，藥后90 d防治效果分別可達(dá)70.83%和62.5%[9]。室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，丙環(huán)唑[10]，45%咪鮮胺水乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和43%戊唑醇懸浮劑[11]，咯菌腈和異菌脲[12]，以及甲基托布津和撲海因?qū)︾牭毒z生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)都有一定的抑制效果[13]。為了尋找更多對(duì)百香果莖基腐病有效的防治藥劑，以便生產(chǎn)中輪換用藥，減少抗藥性的發(fā)生，本研究對(duì)海南省澄邁縣百香果莖基腐病病原菌進(jìn)行鑒定，并測(cè)定6種藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力，旨在為百香果莖基腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從海南省澄邁縣永發(fā)百香果基地收集病樣，參考方中達(dá)等[14]的方法分離病菌備用。藥劑包括250 g/L丙環(huán)唑乳油，陜西恒潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司產(chǎn)；250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油，浙江禾本科技有限公司產(chǎn)；450 g/L咪鮮胺水乳劑，湖南萬(wàn)家豐科技有限公司產(chǎn)；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司產(chǎn)；500 g/L嘧菌酯懸浮劑，江蘇瑞邦農(nóng)藥廠有限公司產(chǎn)；30%噁霉靈水劑，四川潤(rùn)爾科技有限公司產(chǎn)。培養(yǎng)基包括PDA，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8～7.0；PCA，馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用組織分離法，將莖基部病健交界處剪成小塊，70%酒精浸泡10 s，1%升汞浸泡1 min后，置于PDA平板中培養(yǎng)純化，并命名baiLD，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谥虏×y(cè)定和鑒定試驗(yàn)。

1.2.2 形態(tài)鑒定 用接種針挑取菌絲到1 000倍顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)。

1.2.3 致病性測(cè)定 純化后的病原菌鏡檢到分生孢子后，用無(wú)菌水沖洗分生孢子，制成1×107個(gè)/mL孢子懸浮液澆灌百香果苗，每株50 mL，以澆灌清水為對(duì)照，每重復(fù)3株，重復(fù)3次，接種后30 d觀察其發(fā)病癥狀是否與病樣癥狀一致。

1.2.4 分子鑒定 將純化病菌baiLD寄送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行ITS區(qū)測(cè)序分析和分子鑒定，測(cè)序得到544 bp的ITS序列，將其在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，下載相似性較高的ITS序列，以膠孢炭疽菌F210235 (登錄號(hào)：KX197394)為外源參照序列，采用MEG X[7]軟件鄰近距離法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育關(guān)系。

1.2.5 藥劑配制 藥劑配制參考陳圓等[16]的方法。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)測(cè)試，將供試藥劑濃度設(shè)計(jì)為：250 g/L丙環(huán)唑乳油25、31.25、62.5、125、250 mg/L，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油25、31.25、62.5、125、250 mg/L，450 g/L咪鮮胺水乳劑9、45、90、450、500 mg/L，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑87.5、175、350、700、1 400 mg/L，500 g/L嘧菌酯懸浮劑62.5、125、250、500、1 000 mg/L，30%噁霉靈水劑37.5、75、150、300、600 mg/L。

1.2.6 藥劑毒力測(cè)定 菌絲生長(zhǎng)速率法[15]：將煮沸的PDA分裝到三角錐瓶中，每瓶49 mL，高壓滅菌后，分別加入各濃度藥液1 mL，再分別倒入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，每皿約16 mL，制成含藥培養(yǎng)基，每種藥劑5個(gè)濃度處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，以加等量無(wú)菌水的PDA平板為對(duì)照。用直徑0.5 cm打孔器在病原菌菌落邊緣取適量菌餅，菌面朝下接入含藥和對(duì)照平板中央，放入28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算供試藥劑對(duì)病原菌菌絲的相對(duì)抑制率。相對(duì)抑制率(%)=(對(duì)照菌落平均增長(zhǎng)直徑-藥劑處理菌落平均增長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落平均增長(zhǎng)直徑×100。

孢子萌發(fā)法[16]：將1×107個(gè)/mL孢子懸浮液各取1 mL放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入溫度50 ℃左右滅菌PDA制成分生孢子平板，然后用滅菌的直徑0.5 cm濾紙片從低濃度到高濃度蘸取供試藥劑藥液，以蘸取無(wú)菌水的濾紙片為對(duì)照，置于分生孢子平板中，每皿1片，每個(gè)處理重復(fù)3次，7 d后用十字交叉法測(cè)量各處理的抑菌圈直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率。相對(duì)抑制率(%)=處理抑菌圈直徑/培養(yǎng)皿直徑×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌形態(tài)

分離獲得的病菌屬真菌界半知菌類，菌絲透明，具分隔，在側(cè)生的孢子梗上著生分生孢子。大型分生孢子鐮刀形，略彎，兩端稍尖，具隔膜2～5個(gè)，多為3個(gè)，大小(22.6～37.4) μm×(2.5～4.2) μm，足胞明顯(見(jiàn)圖1)。

圖1 分離獲得的百香果莖基腐病病菌PDA培養(yǎng)和分生孢子形態(tài)

2.2 病菌致病性測(cè)定

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種病菌的9株百香果苗有7株發(fā)病，發(fā)病率約為78%，其中2株未發(fā)病可能由于百香果苗品種差異引起；對(duì)照未發(fā)病。發(fā)病株枯萎，莖基部變褐壞死，與病樣癥狀一致，符合柯赫氏法則，重新組織分離純化后得到同樣病原菌，命名為baiLD。

2.3 分子鑒定

將病菌baiLD ITS序列在NCBI中BLAST比對(duì)，得到相似性較高的多條ITS序列。與腐皮鐮刀菌FusariumsolaniSY1(登錄號(hào)：MT605584)、FD1(登錄號(hào)：MN015032)、W5-3(登錄號(hào)：MK764995)、BLH-W1(登錄號(hào)：MG836251)、MR29(登錄號(hào)：MW509863)的ITS序列相似性為100%；與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporumisolate FOM-12(登錄號(hào)：MN272279)和尖孢鐮刀菌辣椒專化型Fusariumoxysporumf. sp.ciceris(登錄號(hào)：KU097320)ITS序列相似性為84.6%；與層生鐮刀菌Fusariumproliferatum菌株RS_79(登錄號(hào)：MK332493)和Fusariumproliferatum菌株CanR-8(登錄號(hào)：JF817300) 序列相似性為83.27%。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，菌株baiLD與鐮刀菌屬多條序列聚在1個(gè)大的分支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株baiLD為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani(見(jiàn)圖2)。

圖2 百香果莖基腐病病菌baiLD基于ITS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 室內(nèi)毒力測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果看出，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油的EC50最小，為0.337 2 mg/L，其次是450 g/L咪鮮胺水乳劑，其EC50為0.474 9 mg/L，再次是70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，其EC50為0.7 172 mg/L；而450 g/L咪鮮胺水乳劑的EC90為1.210 2 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他藥劑的EC90值。結(jié)合回歸曲線來(lái)看，斜率越大，病菌對(duì)該藥劑的敏感性差異越小[17]，因此，450 g/L咪鮮胺水乳劑對(duì)百香果腐皮鐮刀菌的毒力最強(qiáng)(見(jiàn)表1和圖3)。

表1 6種藥劑對(duì)百香果腐皮鐮刀菌Fusarium solani菌絲生長(zhǎng)的毒力比較

咪鮮胺水乳劑9 mg/L對(duì)分生孢子的抑制效果最好，抑菌圈直徑最大，為6.23 cm，相對(duì)抑制率為74.78%；其4.5 mg/L的抑制效果次之，相對(duì)抑制率為61.44%；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 400 mg/L的抑菌圈直徑較大，為4.8 cm，相對(duì)抑制率為58.89%。250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油處理濃度中，250 mg/L的相對(duì)抑制率最大，為33.67%；而丙環(huán)唑乳油250 g/L處理的相對(duì)抑制率最高，30%噁霉靈水劑37.5～600 mg/L對(duì)病菌分生孢子無(wú)抑制作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)450 g/L咪鮮胺水乳劑處理的病菌分生孢子抑菌圈界線清晰，藥劑持效期較長(zhǎng)(見(jiàn)表2和圖3)。

圖3 3種藥劑對(duì)百香果腐皮鐮刀菌菌絲和分生孢子生長(zhǎng)(右下)的抑制作用

表2 6種藥劑對(duì)百香果腐皮鐮刀菌Fusarium solani分生孢子的抑制作用比較

3 結(jié)論與討論

百香果種植周期短，收益快，海南省各(市)縣百香果種植面積逐年增加，百香果產(chǎn)業(yè)在海南省脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要作用。莖基腐病是海南省百香果生產(chǎn)的主要病害，成為制約海南省百香果產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步擴(kuò)大的關(guān)鍵因素。本研究對(duì)海南省澄邁縣百香果莖基腐病樣病原菌進(jìn)行了分離純化，結(jié)合田間癥狀、形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定、ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani。這與林泗海等[2]的研究報(bào)道一致，而與詹儒林等[6]報(bào)道的海南省瓊海市西番蓮莖基腐病病原菌不同，說(shuō)明海南省百香果莖基腐病的病原菌不唯一，有可能是多種病原菌復(fù)合侵染所致。室內(nèi)毒力測(cè)定中，百香果腐皮鐮刀菌對(duì)450 g/L咪鮮胺水乳劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑較敏感，尤其是450 g/L咪鮮胺水乳劑，其對(duì)百香果腐皮鐮刀菌絲和分生孢子都有較強(qiáng)的抑制作用，可進(jìn)一步用于大田試驗(yàn)。供試藥劑EC50僅作為百香果鐮刀菌的室內(nèi)毒力參考，不能直接應(yīng)用于田間，供試6種藥劑在田間防治效果有待進(jìn)一步研究。