奇異根串珠霉菌拮抗放線菌的篩選與鑒定

余鳳玉，祝安傳，2，楊德潔，宋薇薇，唐慶華，牛曉慶

(1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/院士團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新中心，海南文昌，571339；2 海南熱帶海洋學(xué)院，海南三亞，572022)

奇異根串珠霉Thielaviopsisparadoxa寄主范圍非常廣泛，包括重要經(jīng)濟(jì)作物，如甘蔗、海棗、香蕉、高粱、可可、紅薯、椰子、菠蘿、玉米和其他棕櫚植物[1-5]。奇異根串珠霉菌可感染植物的任何部位，引起瀉血、葉燒、心腐和芽腐等癥狀，不同棕櫚樹(shù)癥狀有所不同[1，6]。為害椰子引起瀉血病、莖干腐爛病、芽腐病，為害海棗Phoenixdactylifera和平葉棕Howeaforsteriana、油棕Elaeisguineensis[7-8]引起莖腐病，為害椰棗引起黑色焦枯[9-10];此外，還可引起泰國(guó)酒瓶椰Hyophorbelagenicaulis[11]、檳榔Arecacatechu、Phoenixafricanus、棕竹Rhapisexcelsa、大王椰Roystonearegia、菜棕Sabalpalmetto、金山葵Syagrusromanzoffiana和華盛頓棕Washingtoniafilifera的芽腐病[12-13]，被認(rèn)為是一種攻擊性強(qiáng)、難以控制的病原菌，可通過(guò)雨水、風(fēng)、昆蟲(chóng)、嚙齒類小動(dòng)物及田間活動(dòng)傳播[1-2，14]。生產(chǎn)上防治該菌引起的病害主要使用化學(xué)藥劑，這不僅可能引起病原菌產(chǎn)生抗(耐)藥性，同時(shí)也把天敵昆蟲(chóng)殺死，藥劑飄散空氣中對(duì)生態(tài)環(huán)境還會(huì)造成一定的危害，這與《海南生態(tài)省建設(shè)規(guī)劃綱要》中提到的大力發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，為人民群眾提供安全放心的綠色食品的宗旨不符，急需尋找新的防治方法。利用拮抗放線菌資源是植物病害生物防治的主要途徑之一，不僅無(wú)化學(xué)防治帶來(lái)的副作用，還能維持生態(tài)平衡[15]。目前，奇異根串珠霉菌的生物防治主要集中在拮抗真菌資源的利用[11，16-19]，拮抗放線菌利用較少。放線菌是重要的微生物資源，與人類生活密切相關(guān)，許多新的生化藥劑都是放線菌的次生代謝產(chǎn)物。本研究采集檳榔根際土壤進(jìn)行放線菌分離，篩選對(duì)奇異根串珠霉菌有良好抑菌效果的菌株，并進(jìn)行鑒定，為放線菌后續(xù)防效及應(yīng)用提供支持，豐富奇異根串珠霉菌生防微生物資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

在海南省10個(gè)檳榔園采集土壤(見(jiàn)表1)，選取植株根部5～10 cm深處土壤，裝入干凈塑封袋中，并標(biāo)明采樣日期和地點(diǎn)等帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 海南省檳榔園土樣采集地點(diǎn)

1.2 菌株和藥劑

供試靶標(biāo)菌：棕櫚科植物病原真菌奇異根串珠霉菌Thielaviopsisparadoxa，來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所植物保護(hù)研究中心。供試藥劑：50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑，拜耳作物科學(xué)公司產(chǎn)；750 g/L十三嗎啉乳油，上海生農(nóng)生化制品有限公司產(chǎn)。

1.3 放線菌的分離與純化

采用平板梯度稀釋法[20]，把土壤稀釋液涂布在含重鉻酸鉀150 mg/L溶液的改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃人工氣候箱中倒置培養(yǎng)10 d，重復(fù)3次。用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落，將其移至改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基上畫(huà)線培養(yǎng)，轉(zhuǎn)代2～3次純化后，斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 拮抗放線菌的篩選

1.4.1 初篩 在PDA平板(直徑9 cm)中央接入直徑0.6 cm的奇異根串珠霉菌菌塊，再以十字交叉法在邊緣接入4株不同的放線菌菌餅，對(duì)照只接種奇異根串珠霉菌，在人工氣候箱中28 ℃培養(yǎng)2 d后，以十字交叉法測(cè)量菌落大小。

1.4.2 復(fù)篩 采用菌絲生長(zhǎng)速度法，放線菌發(fā)酵液的制備參考文獻(xiàn)[21]。取制備好的發(fā)酵液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取濾液2 mL、供試藥劑分別與融化后冷卻至50～60 ℃的PDA 18 mL混勻，倒入直徑9 cm培養(yǎng)皿中制成平板，以加無(wú)菌水2 mL的PDA為對(duì)照。在平板中間接入直徑0.6 cm的奇異根串珠霉菌餅，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)。待對(duì)照長(zhǎng)滿平板后，采用十字交叉法測(cè)量菌落大小。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[22]，菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑) ×100。

1.5 拮抗放線菌鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 培養(yǎng)特征觀察、形態(tài)鑒定及生理生化試驗(yàn)參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[23]的方法進(jìn)行。

1.5.2 分子鑒定 以細(xì)菌通用引物27F/1492R[24]對(duì)菌株D2-3的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：2×Power Taq PCR Mastermix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸8 min，10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物寄往生工生物工程股份有限公司測(cè)序，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌篩選

從供試土壤樣品中分離純化得到放線菌120株，初篩出22株對(duì)奇異根串珠霉菌有抑菌效果，將其進(jìn)行復(fù)篩；4株放線菌發(fā)酵液對(duì)奇異根串珠霉菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率大于90%。其中菌株D2-3抑菌率為99.76%，顯著高于其他菌株的抑菌率，與50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑1 μg/mL的抑菌效果相當(dāng)，顯著高于750 g/L十三嗎啉乳油(1 μg/mL)的抑菌效果(見(jiàn)表2和圖1)，確定為優(yōu)勢(shì)拮抗菌株，并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。

圖1 放線菌D2-3等4個(gè)菌株發(fā)酵液及藥劑對(duì)奇異根串珠霉菌的平板抑制作用

表2 放線菌發(fā)酵液對(duì)奇異根串珠霉菌的抑制作用

2.2 拮抗放線菌D2-3鑒定

2.2.1 形態(tài)和培養(yǎng)特征 在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，放線菌D2-3菌落圓形，干燥，中間隆起，不透明，邊緣整齊，氣生菌絲和基內(nèi)菌絲開(kāi)始均呈白色，慢慢變?yōu)榛野字磷匣疑?，后期變?yōu)楹谏瑹o(wú)可溶性色素產(chǎn)生。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲由中心向四周輻射生長(zhǎng)，多為直線狀，少許彎曲；氣生菌絲發(fā)達(dá)，有分支，成熟后斷裂，可分化出孢子絲(見(jiàn)圖2)。

圖2 放線菌菌株D2-3菌絲形態(tài)及高氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

2.2.2 生理生化特征 放線菌D2-3不能使明膠液化，不產(chǎn)生淀粉酶，不能水解纖維素，不產(chǎn)生硫化氫；能使牛奶胨化，能還原硝酸鹽；能利用天門冬氨酸、色胺酸等氮源，不能利用肌醇、甘露醇、精氨酸等氮源；供試的葡萄糖、鼠李糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖等碳源均不能利用。

2.2.3 16S rNDA序列分析 經(jīng)測(cè)序，放線菌D2-3的核酸序列長(zhǎng)度為1 024 bp(GenBank登錄號(hào)：ON786711)，BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與桑樹(shù)鏈霉菌Streptomycessamsunensis(登錄號(hào)：MK530504)相似性達(dá)99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一獨(dú)立分支上(見(jiàn)圖3)。結(jié)合以上研究，確定放線菌D2-3為鏈霉菌屬的桑樹(shù)鏈霉菌S.samsunensis。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的放線菌D2-3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論與討論

由奇異根串珠霉菌引起的椰子瀉血病、莖干腐爛病是椰子的重要病害，目前主要以化學(xué)防治為主，以拮抗放線菌為代表的生物防治鮮有報(bào)道。以放線菌為代表的生防微生物及其代謝物種類豐富，是生物防治植物病害的重要來(lái)源，已廣泛用于新藥研發(fā)和生防微生物作用機(jī)制研究[25]。本研究從海南省文昌市、瓊海市、萬(wàn)寧市、定安縣及屯昌縣共10個(gè)檳榔園土壤樣品中分離純化獲得放線菌120株，初篩出22株對(duì)奇異根串珠霉菌有抑菌活性，占獲得的放線菌總數(shù)的18.33 %；復(fù)篩后獲得4株菌株抑菌效果達(dá)90 %以上，編號(hào)分別為D2-3、G1-12、D2-9和G9-4。經(jīng)鑒定，菌株D2-3為桑樹(shù)鏈霉菌Streptomycessamsunensis，屬于紫黑鏈霉菌Streptomycesviolaceusniger16S rRNA 基因進(jìn)化分支[26]。

紫黑鏈霉菌是新型抗生素開(kāi)發(fā)與利用的重要菌源，許多重要的抗生素均由該菌產(chǎn)生，對(duì)植物病害具有良好的拮抗效果[27-29]。桑樹(shù)鏈霉菌對(duì)植物病原菌的防控效果研究報(bào)道較少，劉一賢等[27-28]從云南省植膠區(qū)根際土壤中篩選到對(duì)橡膠樹(shù)多種重要病害都具有較強(qiáng)抑制作用的桑樹(shù)鏈霉菌17-7。本研究篩選到的桑樹(shù)鏈霉菌菌株D2-3，對(duì)奇異根串珠霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到99.76%，生防應(yīng)用前景良好。下一步擬對(duì)該菌抑菌譜，發(fā)酵條件，以及在椰子植株體內(nèi)和栽培基質(zhì)中的定殖能力，定殖后的生防能力等方面進(jìn)行深入研究，并分析其代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)，明確其抑菌機(jī)制，為該菌的利用奠定基礎(chǔ)。