柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的結(jié)構(gòu)、分類與進化分析

胡亞平，郭雁君，吉前華，蔣 惠，楊鳳梅，郭麗英

(肇慶學院果樹研究所/肇慶學院生命科學學院，廣東肇慶，526061)

幾丁質(zhì)(Chitin)又稱甲殼素，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接而成的線性多糖，是細菌、真菌、線蟲、甲殼動物、昆蟲等物種外殼細胞壁的主要成分[1]。植物在受到真菌等病原侵襲時，其幾丁質(zhì)酶基因被誘導大量表達，產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可將真菌等病原的細胞壁幾丁質(zhì)降解為N-乙酰氨基葡萄糖，破壞病原的細胞壁，拮抗侵染[2]。電鏡觀察結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶常作用于菌絲頂端新合成的幾丁質(zhì)壁，使頂端壁合成中的代謝平衡被破壞，使頂端膨脹并融解，從而達到抑菌效果[3]。幾丁質(zhì)酶被用作基因工程提高植物抗病能力的靶標，通過轉(zhuǎn)入外源幾丁質(zhì)酶基因、提高內(nèi)源幾丁質(zhì)酶表達水平、改造植物原有的幾丁質(zhì)酶基因或?qū)锥≠|(zhì)酶基因與其他基因聯(lián)合表達，都有成功提高植物抗病能力的報道[4-18]。將柑桔的幾丁質(zhì)酶基因進行整理、歸類和分析，了解每個基因的特性，清楚其作用，對利用幾丁質(zhì)酶基因提高柑桔抗病能力、提高柑桔產(chǎn)量和品質(zhì)有積極作用。

1 材料與方法

1.1 蛋白質(zhì)生物基本信息分析在華中農(nóng)業(yè)大學公布的柑桔基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)上檢索關(guān)鍵詞“Chitinase”，獲得柑桔的32個幾丁質(zhì)酶基因的DNA序列、蛋白質(zhì)序列、染色體位置、內(nèi)含子和外顯子等信息。使用Vector NTI 11.5軟件對信息進行整合，并分析這些基因的分子量、等電點等。

1.2 信號肽、細胞定位分析信號肽是引導新合成的蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移(或定位)的氨基酸序列，長度5～30個氨基酸殘基，通常位于N-末端。使用SignalP 4.1和phobius兩種軟件預(yù)測信號肽，使用phobius和TMHMM軟件可對蛋白在細胞中的定位進行分析。

1.3 保守結(jié)構(gòu)域分析保守結(jié)構(gòu)域是指在生物進化或者一個蛋白家族中具有不變或相同的結(jié)構(gòu)域，他們一般具有重要的功能，不能被改變。采用NCBI網(wǎng)站上的Conserved Domain Search軟件對柑桔幾丁質(zhì)酶蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹使用Vector NTI 11.5軟件，選取最大似然法得到柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族在柑桔染色體上的位置分布基于全基因組序列，共獲得32個幾丁質(zhì)酶基因成員。有26個基因分布在柑桔染色體1、4、5、7、8、9上，在4、5、7、8染色體上部分基因成簇排列、彼此距離非常接近；其余6個成員(編號以orange1.1t開頭的基因)未能定位于染色體上(見表1)。

2.2 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的長度和分子量32個柑桔幾丁質(zhì)酶基因所編碼蛋白質(zhì)的分子量在14 851.52～72 736.09 Da之間。其中，orange1.1t00476.1編碼蛋白分子量最大，長達636 個氨基酸(aa)；Cs5g21860.1編碼蛋白等電點(9.15)是所有幾丁質(zhì)酶中最高的。Cs5g21890.1編碼蛋白分子量最小，僅134 個aa，其等電點也是最小的，僅為4.53(見表1)。

表1 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的特征

2.3 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的信號肽及細胞學定位使用SignalP，Phobius和TMHMM 3種軟件分析柑桔幾丁質(zhì)酶家族蛋白的信號肽以及細胞定位，由此可以將它們分為4種類型。23個幾丁質(zhì)酶屬于第1種類型(圖1A、B、C)：有信號肽且定位在細胞外，說明這些蛋白在信號肽的介導下輸出到細胞外執(zhí)行生物功能。6個幾丁質(zhì)酶屬于第2種類型(圖1D、E、F)：有信號肽，是跨膜蛋白，大部分位于細胞外，中間有一小段跨膜區(qū)域，C端位于細胞內(nèi)。2個幾丁質(zhì)酶屬于第3種類型(圖1G、H、I)：無信號肽，定位在細胞外。1個幾丁質(zhì)酶(orange1.1t00476.1)屬于第4種類型(圖1J、K、L)：無信號肽，是跨膜蛋白。

注：使用Phobius(圖A、D、G、J)，TMHMM(圖B、E、H、K)和SignalP(圖C、F、I、L)三種軟件對幾丁質(zhì)酶家族蛋白進行分析的結(jié)果。圖A、B、C以Cs1g26330.1為例，圖D、E、F 以Cs5g21890.1為例，圖G、H、I 以Cs4g01410.2為例，圖J、K、L是orange1.1t00476.1。

2.4 柑桔幾丁質(zhì)酶家族基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平在柑桔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)，可以得到每個基因的相對表達量。在葉子中，基因Cs5g24680.1相對表達量最高，其次是orange1.1t05124.1、Cs9g18700.1、Cs8g01810.1和Cs8g01810.2，其他的基因相對表達量較少；在果實中，基因cs5g24680.1相對表達量最高，其他的基因相對表達量都較低；在愈傷組織中，基因Cs9g18700.1相對表達量最高，其次是Cs5g24680.1，Cs5g21860.1 、Cs9g14710.1等基因，其他基因的相對表達量較低；在花朵中，基因Cs8g01840.1的相對表達量最高，其次是cs5g24680.1，Cs8g01810.1、Cs8g01810.2、orange1.1t05124.1，Cs8g01850.1，其他基因相對表達較低(見表2)。

表2 柑桔幾丁質(zhì)酶的家族基因在植物愈傷組織、花、葉、果實中的轉(zhuǎn)錄水平(相對表達量)

2.5 柑桔幾丁質(zhì)酶家族基因保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育樹將這些幾丁質(zhì)酶的蛋白序列用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2A所示。用NCBI Conserved Domain Search分析這32個基因的結(jié)構(gòu)域，并將它們放在一起進行比較，結(jié)果見圖2B所示。將基因信號肽、細胞學定位分析的結(jié)果做成簡圖，結(jié)果如圖2C所示。綜合三者的分析結(jié)果，可以將32個柑桔幾丁質(zhì)酶分為4類。

第Ⅰ類(圖2A藍色線條，5個)：都含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，同時具有糖基水解酶的功能(圖2B)，都含信號肽且定位在細胞外(圖2C)。

第Ⅱ類(圖2A綠色線條，10個)：都含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，同時具有糖基水解酶的功能，大部分基因除此之外還含有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域(圖2B)，多數(shù)是含有信號肽的跨膜蛋白(圖2C)。

第III類(圖2A紅色，16個)：都含有GH19幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，它同時具有溶菌酶的活性，部分基因還含有幾丁質(zhì)結(jié)合域(圖2B)，都有信號肽且定位在細胞外(圖2C)。

第IV類(圖2A黑色，1個)：含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，同時具有糖基水解酶的功能，此外還含有一個PPR重復，是抗病蛋白中一個常見的結(jié)構(gòu)域，功能未知(圖2B)，是個無信號肽的跨膜蛋白(圖2C)。

注：圖左是基于基因編碼蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，中間是對應(yīng)基因的保守結(jié)構(gòu)域簡圖，圖右是這些基因編碼的信號肽和細胞定位，左側(cè)箭頭代表有信號肽，中間箭頭代表定位在細胞外部分，右側(cè)箭頭代表定位在細胞內(nèi)的部分。

3 討論

植物幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)可以分為N-端信號肽區(qū)、主結(jié)構(gòu)區(qū)(催化區(qū))和C-端延伸區(qū)三部分，有的在N-端信號區(qū)之后有富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合域，它與主結(jié)構(gòu)區(qū)之間有一段可變交聯(lián)區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)，柑桔幾丁質(zhì)酶家族全部帶有催化功能區(qū)，該區(qū)主要負責催化功能，切斷幾丁質(zhì)以達到抗病作用；其中，第Ⅰ、Ⅱ、IV類柑桔幾丁質(zhì)酶含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，含有GH18結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶廣泛存在于病毒、細菌、真菌、昆蟲、節(jié)肢動物、植物和哺乳動物中，其主要功能是分解周圍環(huán)境中的幾丁質(zhì)，以滿足其自身對營養(yǎng)的需求，而對真菌的抑制能力較弱；第III類柑桔幾丁質(zhì)酶含GH19幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，含GH19結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶主要存在于植物中，有糖基化水解酶功能，其功能主要是抑制病原真菌的生長，進行自我防御，可能在植物抗病過程中具有較為重要的功能[19]。

不同類型的幾丁質(zhì)酶及其在細胞中定位的不同，使其在抗真菌中的作用也不同[1，20]。體外抑菌試驗中，堿性幾丁質(zhì)酶具有最高抗菌活性，而其他的幾丁質(zhì)酶則幾乎無抑菌活性。本研究對柑桔幾丁質(zhì)酶等電點進行分析顯示(表1)，等電點大于8的幾丁質(zhì)酶有11個，可能具有較高的抗菌活性。多數(shù)細菌的幾丁質(zhì)酶等電點為酸性，放線菌的幾丁質(zhì)酶等電點一般為中性或堿性，而植物的幾丁質(zhì)酶等電點往往為較強酸性或較強堿性[19]。柑桔[15]絕大多數(shù)幾丁質(zhì)酶(26個)帶有信號肽(長度在20～30氨基酸殘基)，表明這部分酶是在信號肽介導下輸出到細胞外發(fā)揮作用；部分酶(7個)帶有C端延伸區(qū)，以跨膜蛋白形式存在。在植物體內(nèi)，細胞間隙定位的幾丁質(zhì)酶被認為與宿主早期防御反應(yīng)有關(guān)，它可以間接地釋放真菌誘導因子從而激發(fā)進一步的防衛(wèi)反應(yīng)[5]。在本研究鑒定出的第Ⅱ類幾丁質(zhì)酶中，有7個為跨膜蛋白，可能與宿主早期防御反應(yīng)有關(guān)。

正常情況下，植物中的幾丁質(zhì)酶活性很低，但在受到病原物及其激發(fā)子、乙烯、水楊酸、紫外線及重金屬等的誘導下，其活性迅速提高[21]。許多植物在感染病毒后幾丁質(zhì)酶活性急劇升高，而且會同時產(chǎn)生多種幾丁質(zhì)酶[22]。TMV病毒不僅能誘導黃瓜幾丁質(zhì)酶局部活性達600倍，而且還能誘導整個系統(tǒng)獲得此酶活性[23]。真菌及其激發(fā)子可誘導植物中幾丁質(zhì)酶的活性急劇增加，在番茄、豌豆、油菜、菜豆等受到病原真菌侵染時均可產(chǎn)生較高的幾丁質(zhì)酶活性，且多種類型的幾丁質(zhì)酶共存；當用真菌細胞壁或激發(fā)子處理胡蘿卜和馬鈴薯時也發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶活性增加[20]。植物幾丁質(zhì)酶還可受一些物理及化學因素誘導，在鹽溶液噴灑、受傷、紫外輻射、升汞處理時，幾丁質(zhì)酶活性也會被誘導[24，25]。