1日齡雛雞胎糞禽白血病檢測流程的建立*

陳小嬌，張妹，康翠翠，陳文平

（1.北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司，北京 101206；2.國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系平谷綜合試驗站，北京 101206）

禽白血病（Avian Leukosis，AL）是可垂直傳播的病毒性腫瘤病，呈世界性分布，嚴重制約著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。由于該病的防治無有效藥物和疫苗，唯一有效的控制方法就是對核心雞群進行凈化。近幾年，大多數(shù)養(yǎng)禽場已開展核心雞群禽白血病的研究與凈化工作，而1日齡雛雞胎糞禽白血病P27檢測是建立陰性雞群的第一步，對禽白血病凈化起到關(guān)鍵作用。

1 準備胎糞樣品稀釋液

不同廠家的禽白血病P27試劑盒的檢測要求不同，根據(jù)說明書使用對應的胎糞樣品稀釋液。同時在出雞前需準備足夠的樣品稀釋液，根據(jù)種蛋入孵數(shù)量和所入選品系的種蛋受精率、孵化率來計算出雛數(shù)量。如果種蛋入孵10 000枚，假設(shè)受精率、孵化率分別為90%、80%，那么出雛數(shù)量是：10 000×90%×80%=7200（只）。那么需要準備胎糞樣品稀釋液7200份，每個離心管中加入0.5 mL樣品稀釋液[1]。

2 采集胎糞樣品

雛雞鑒別人員負責胎糞樣品的采集工作，對出雛紙袋中剛出殼的每只雛雞進行翻肛性別鑒別，逐只采集雛雞胎糞，擠到加有0.5 mL稀釋液的2 mL離心管中，在離心管蓋上用馬克筆標記家系號[2]，將采集完的胎糞樣品置于常溫放置。胎糞樣品采集前，鑒別人員的雙手應進行徹底消毒，在完成一個家系雞只胎糞采集后雙手還要再次消毒，避免不同家系間感染；若采集過程中手指沾到大量胎糞時，應及時進行消毒，避免引起相同家系間雞只的交叉感染。從采樣環(huán)節(jié)嚴格控制不同家系間或同一家系雞只的交叉感染，能夠有效保障檢測結(jié)果的準確性。

3 胎糞樣品凍融

3.1 胎糞樣品混勻

將采有胎糞樣品的離心管上下左右搖晃、震蕩，直至胎糞塊與稀釋液完全融合；為防止離心管掉到液氮罐中，避免出現(xiàn)漏檢，需將搖勻的樣品放到紗布袋里，收緊口袋，置于液氮罐中保存。

3.2 胎糞樣品凍融

將胎糞樣品按不同品系分類放到不同的液氮罐里，冷凍5 min。之后取樣人員雙手一定要帶上棉線手套，用大鑷子夾取長繩，慢慢往上拉出樣品，將取出的胎糞樣品在空氣中停留至無液氮揮發(fā)后，方可放到桌面。放置時，注意離其他人員遠一點。

3.3 胎糞樣品回溫

待胎糞樣品在空氣中放置10 min后，將樣品按著標注的品系、家系的順序碼放于凍存盒內(nèi)。將碼放好的樣品放置38 ℃恒溫箱中回溫直至樣品完全解凍，一般樣品回溫1.5 h即可。

4 胎糞樣品加樣處理

4.1 加樣前樣品混勻

樣品解凍后，蓋上凍存盒蓋子，整板震蕩，讓胎糞與稀釋液充分混勻，之后靜置2 min，液面分成上下兩層。

4.2 加樣劑量

為確保酶標板中樣品反應時間一致，將待檢胎糞樣品按照一定順序加入到一次性反應板孔內(nèi)，加樣時要吸取上清液150 μL，切忌樣品混有沉淀。如果有的待檢樣品上清液量不足，則可傾斜離心管貼壁吸取上清液；如果上述操作后上清液吸取量還是達不到要求，則可在待檢胎糞樣品中加入0.2 mL稀釋液。

4.3 記錄信息

加樣人員每加完一板胎糞樣品后，需在一次性反應板和凍存盒上標清楚對應的品系及板號，并將各個板和凍存盒按著順序碼放在固定的位置上，便于實驗人員、數(shù)據(jù)統(tǒng)計人員進行操作，以便應對突發(fā)情況。每塊反應板中胎糞樣品信息由專人負責登記，需詳細記錄檢測的第幾板、品系、家系、加樣人姓名等相關(guān)信息。

5 胎糞樣品實驗室檢測流程

5.1 試劑盒操作流程

胎糞樣品禽白血病p27檢測嚴格按照試劑盒實驗操作說明書進行，檢測前將試劑盒置于25 ℃恒溫箱中回溫2.5 h，確保試劑結(jié)晶完全融化后方可使用。

5.2 檢測流程的控制

5.2.1 人員合理分配 出雛后4 h內(nèi)完成雞只胎糞樣品檢測工作，以確保雛雞的健康。由于檢測任務(wù)比較重、時間緊迫，需合理組織與安排人員，做好ELSIA實驗檢測流程的管控與記錄，確保試驗順利進行，保證檢測結(jié)果的準確性。檢測人員分為2組，實施8 h工作交替。兩組各環(huán)節(jié)的負責人需要交接工作進程，保證每個環(huán)節(jié)能夠有條不紊地開展下一階段的工作。

5.2.2 溫度的控制 實驗過程中酶標板需在恒溫中孵育，溫度直接影響酶的活力，是酶標反應實驗中關(guān)鍵項，其注意事項為：一是保證實驗前將試劑盒中各個試劑及酶標板在室溫（25～28℃）回溫2.5 h；二是樣品檢測過程中，確保酶標板的每一個反應環(huán)節(jié)均在試劑盒要求的溫度下進行。

5.2.3 時間的控制 為準確把握檢測中每個環(huán)節(jié)的反應時間，每次加完試劑后均使用計時器計時，并且實驗操作中要不斷計算各板之間的時間間隔，合理安排每塊板的時間，保證實驗時間的準確性。

6 檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及反饋

數(shù)據(jù)統(tǒng)計人員首先將胎糞樣品編號提前輸入EXCEL表格中，輸號期間需要兩個人密切配合核對數(shù)據(jù)，確保每一份樣品編號準確。檢測完畢后將檢測數(shù)據(jù)從軟件中導出，并將其與輸入的樣品編號進行合并，篩選出陽性雞只的編號。數(shù)據(jù)統(tǒng)計后，經(jīng)負責人審核確認無誤后，方可將檢測的陽性編號反饋給生產(chǎn)負責人。

7 雞只淘汰方法

雛雞出殼后，嚴格篩選出健康雞只，同一個小家系的雛雞放入一個帶有透氣孔的紙袋內(nèi)，標記家系號。經(jīng)過免疫后的雛雞按照家系號順序放置在出雛場地，然后按照家系分類每只雛雞裝入一個帶有透氣孔的紙袋中，并放在白色塑料篩上。待檢測結(jié)果反饋后，及時淘汰陽性雞。需注意：同一只母雞所產(chǎn)雛雞中有一只陽性雞就要全部淘汰同紙袋中雛雞，同時追溯到種雞，淘汰相應的種母雞。最終，將健康的雞只運送至育雛場。

8 結(jié)論

禽白血病的水平傳播主要發(fā)生在孵化期間和出雛后的前兩周內(nèi)，尤其是雛雞出殼后48 h內(nèi)具有很強的傳染性、傳播性，因此，1日齡胎糞檢測是禽白血病凈化程序最重要的一環(huán)，是“重中之重”[3]。本研究梳理出一套適合規(guī)?；B(yǎng)殖場1日齡雛雞胎糞禽白血病檢測流程，且在禽白血病凈化生產(chǎn)應用中也取得了較好的效果，為國內(nèi)種雞場禽白血病凈化的示范推廣提供技術(shù)支持。