LncRNA BDNF-AS靶向miR-765影響缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的實(shí)驗研究

蔣邦治 唐永剛 韓志安 陳林坤 韋家俊

缺血性腦中風(fēng)是常見的急性腦血管類疾病，也是造成殘疾的主要神經(jīng)系統(tǒng)疾病，氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等系列病理過程參與其發(fā)生發(fā)展；神經(jīng)保護(hù)治療是缺血性腦卒中最重要、最有效的治療手段[1,2]。研究表明lncRNA參與調(diào)控腦缺血后細(xì)胞凋亡、血管生成和炎性反應(yīng)等系列過程，可作為缺血性腦卒中生物標(biāo)志物[3]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子反義RNA(BDNF-AS)是一種天然反義轉(zhuǎn)錄物，有報道精神分裂癥患者血清中l(wèi)ncRNA BDNF-AS呈高表達(dá)，與認(rèn)知能力相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)[4]。下調(diào)LncRNA BDNF-AS表達(dá)對布比卡因誘導(dǎo)的幼脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性損傷有保護(hù)作用[5]。沉默LncRNA BDNF-AS通過抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激來減弱Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性[6]。敲除LncRNA BDNF-AS可通過BDNF-TrkB-PI3K/Akt信號通路減弱缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7]。而LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響及機(jī)制尚不清楚。研究表明miRNA在缺血性腦卒中的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，并參與了腦損傷后的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制的調(diào)控[8]。敲低LncRNA FOXD3-AS1通過miR-765/BCL2L13軸防止腦缺血/再灌注損傷[9]。本實(shí)驗研究LncRNA BDNF-AS是否通過調(diào)控miR-765影響缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷。為神經(jīng)元損傷的機(jī)制以及防治藥物研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞(美國ATCC)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物)；凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解液(艾美捷科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海翌圣生物)。

1.2 細(xì)胞處理與分組 PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞，將其接種于無糖培養(yǎng)液后在含95N2%、5% CO2的培養(yǎng)箱中缺氧缺糖處理12 h，記為模型組，常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；將LncRNA BDNF-AS干擾表達(dá)載體及陰性對照、miR-765模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后進(jìn)行缺氧缺糖處理，記為si-LncRNA BDNF-AS+模型組、si-NC+模型組、miR-765+模型組、miR-NC+模型組；將LncRNA BDNF-AS干擾表達(dá)載體分別與miR-765抑制劑及陰性對照轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后進(jìn)行缺氧缺糖處理，記為anti-miR-NC+si-LncRNA BDNF-AS+模型組、anti-miR-765+si-LncRNA BDNF-AS+模型組。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LncRNA BDNF-AS和miR-765的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為內(nèi)參，LncRNA BDNF-AS上游引物序列：5’-TCACATCTTAGCCCCTTAGCC-3’，下游引物序列：5’-TTTAGCACCCAACAGAATCCC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物序列：5’-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；miR-765上游引物序列：5’-CGGCTCGGATCCGTTAG-3’，下游引物序列：5’-CGACTACCGTTAGCTAGA-3’；U6上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGGCATTATATAC-3’，下游引物序列：5’-AAGGGGCCATGCTAATCTT-3’。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻、避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入Cleaved-caspase3、Bax抗體(1∶800)，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為參照。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測MDA、SOD、CAT水平 收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測。

1.7 雙熒光素酶報告實(shí)驗 構(gòu)建含有miR-765結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA BDNF-AS野生型及突變型報告基因載體，將其分別與miR-NC、miR-765共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，用試劑盒法檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中LncRNA BDNF-AS和miR-765的表達(dá)水平 與對照組相比，模型組LncRNA BDNF-AS表達(dá)水平升高，miR-765表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中LncRNA BDNF-AS和miR-765的表達(dá)水平

2.2 低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響 與對照組相比，模型組LncRNA BDNF-AS表達(dá)水平升高，PC12細(xì)胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA BDNF-AS+模型組LncRNA BDNF-AS表達(dá)水平降低，PC12細(xì)胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)。見表2，圖1、2。

圖1 低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

表2 低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響

2.3 LncRNA BDNF-AS靶向調(diào)控miR-765的表達(dá) LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示LncRNA BDNF-AS和miR-765有結(jié)合位點(diǎn)。miR-765與LncRNA BDNF-AS野生型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后PC12細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。與pcDNA-NC比較，pcDNA-LncRNA BDNF-AS組LncRNA BDNF-AS表達(dá)水平升高，miR-765表達(dá)水平降低(P<0.05)；與si-NC比較，si-LncRNA BDNF-AS組LncRNA BDNF-AS表達(dá)水平降低，miR-765表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖3，表3、4。

圖2 低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 LncBase Predicted v.2對LncRNA BDNF-AS和miR-765結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖

表3 miR-NC或miR-765與LncRNA BDNF-AS野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后雙熒光素酶活性

表4 qRT-PCR檢測miR-765和LncRNA BDNF-AS的表達(dá)

2.4 miR-765對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響 與miR-NC+模型組比較，miR-765+模型組miR-765表達(dá)水平升高，PC12細(xì)胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)。見圖4，表5。

表5 miR-765對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響

圖4 miR-765對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；B Western blot檢測Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)

2.5 anti-miR-765可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響 與anti-miR-NC+si-LncRNA BDNF-AS+模型組比較，anti-miR-765+si-LncRNA BDNF-AS+模型組miR-765表達(dá)水平降低，PC12細(xì)胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5，表6。

表6 anti-miR-765可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響

圖5 anti-miR-765可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；B Western blot檢測Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)

3 討論

缺血性腦卒中是腦組織血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致腦組織局限性或彌漫性缺血缺氧，一種缺血性腦血管疾病，死亡率和致殘率較高，研究在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找重要治療靶點(diǎn)以開發(fā)藥物促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，為臨床策略提供寶貴的見解[10,11]。有研究報道抑制LncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/復(fù)氧損傷的小鼠心肌細(xì)胞中的細(xì)胞死亡和凋亡[12]。敲低LncRNABDNF-AS通過miR-130b-5p/PRDM5 軸在急性脊髓損傷中抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[13]。沉默LncRNA BDNF-AS可減輕缺氧/缺血引起的新生兒腦損傷[14]。抑制LncRNA BDNF-AS通過增加BDNF的水平來保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受缺血損傷[15]。以上研究表明LncRNA BDNF-AS參與調(diào)控多種細(xì)胞損傷過程。本結(jié)果顯示，缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中LncRNA BDNF-AS表達(dá)水平升高(P<0.05)；抑制LncRNA BDNF-AS表達(dá)后，PC12細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3和Bax表達(dá)水平降低(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，SOD和CAT活性升高(P<0.05)；表明抑制LncRNA BDNF-AS表達(dá)可抑制缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激；提示抑制LncRNA BDNF-AS表達(dá)可保護(hù)PC12細(xì)胞免受缺氧缺糖誘導(dǎo)的損傷。這與其他研究中LncRNA BDNF-AS的作用相似。

生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)LncRNA BDNF-AS與miR-765有結(jié)合位點(diǎn)。有研究報道m(xù)iR-765在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中下調(diào)表達(dá)[16]。LINC00173通過靶向miR-765/NUTF2軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[17]。本結(jié)果顯示，缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-765表達(dá)水平降低；過表達(dá)miR-765后，PC12細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase3和Bax表達(dá)水平降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高；表明過表達(dá)miR-765可抑制缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。且本實(shí)驗還證實(shí)LncRNA BDNF-AS靶向調(diào)控miR-765；而抑制miR-765可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)LncRNA BDNF-AS對缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷的影響。

綜上所述，抑制LncRNA BDNF-AS表達(dá)通過靶向調(diào)控miR-765抑制缺氧缺糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷。