hsa_circ_0000734吸附miR-16-5p抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移

彭子輝 王解 張正森 李晶晶

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜組織炎癥、關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)畸形，其確切原因尚不完全清楚[1]?；こ衫w維細(xì)胞在軟骨破壞中起重要作用，越來(lái)越多的證據(jù)表明，活化的滑膜成纖維細(xì)胞可以表現(xiàn)出與腫瘤樣細(xì)胞相似的特性，例如過(guò)度增殖和遷移以及凋亡不足[2,3]?；こ衫w維細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和遷移被認(rèn)為是RA形成的原因[4]。因此，有效抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡有助于RA癥狀的改善。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類新近鑒定的非編碼RNA分子，其特征是沒(méi)有自由5’端帽子或3’poly(A)尾部的非規(guī)范反向剪接。在過(guò)去的十年中，高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的發(fā)展導(dǎo)致circRNA研究的極速增長(zhǎng)[5]。盡管大多數(shù)circRNA的生物學(xué)功能仍然未知，但逐漸明確的是，circRNA充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)與miRNA結(jié)合在人類疾病中具有調(diào)控功能[6,7]。以往研究顯示，在RA患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中hsa_circ_0000734的表達(dá)明顯降低[8]。然而，hsa_circ_0000734在RA中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在確定hsa_circ_0000734對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響及潛在機(jī)制，以期為RA的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RA滑膜成纖維細(xì)胞系MH7A(美國(guó)ATCC)。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：10567014、10099141)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛世爾，批號(hào)：20200216)；hsa_circ_0000734過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體質(zhì)粒、miR-16-5p mimics和mimics control(上海吉瑪)；Transwell小室(美國(guó)Corning，批號(hào)：356234)；CCK-8試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天研究所，批號(hào)：C0037、P0012A)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(北京索萊寶，批號(hào)：20191203、20200422)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(日本TaKaRa，批號(hào)：RR526A)；PCNA、Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9兔抗單克隆抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：34452、12655、40994、13667)；山羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam，批號(hào)：ab1670)；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒(上海翊圣生物科技，批號(hào)：20191012)；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾，批號(hào)：20191208、20180519)；HF160W型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器)；FR-200A凝膠分析系統(tǒng)(上海普諾森生物)；CFX96 Touch型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 MH7A細(xì)胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞放置在常規(guī)培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件設(shè)為5%CO2、37℃、飽和濕度。對(duì)數(shù)期的MH7A細(xì)胞接種到6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將轉(zhuǎn)染hsa_circ_0000734過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的MH7A細(xì)胞命名為hsa_circ_0000734組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體質(zhì)粒的MH7A細(xì)胞命名為NC組，未行轉(zhuǎn)染處理的MH7A細(xì)胞命名為Mock組。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組MH7A細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)hsa_circ_0000734和miR-16-5p的表達(dá) 使用RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染48 h后各組MH7A細(xì)胞中的RNA，以RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，以cDNA為模板行PCR檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)hsa_circ_0000734的相對(duì)表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參，檢測(cè)miR-16-5p的相對(duì)表達(dá)水平。以2-ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0000734和miR-16-5p的表達(dá)水平。QRT-PCR引物序列如下：hsa_circ_0000734 F 5’-CAGCTGAAGCAGTTGGAGTG-3’；R 5’-GATAACGCGGCGGACTATT-3’。GAPDH F 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’；R 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。miR-16-5p F 5’-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’；R 5’-TGCGTGTCGTGGAGGAGTC-3’。U6 F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 分組處理48 h后各組MH7A細(xì)胞接種至96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)只含培養(yǎng)液不含細(xì)胞的調(diào)零孔，于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，除去培養(yǎng)液，向每孔細(xì)胞中加入CCK-8溶液10 μl，孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞的吸光度(A)值，波長(zhǎng)設(shè)為490 nm，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=[(實(shí)驗(yàn)孔A值-調(diào)零孔A值)/(對(duì)照孔A值-調(diào)零孔A值)]×100%。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 MH7A細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以胰酶消化收集細(xì)胞6×105個(gè)細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液，添加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染液，混勻，避光反應(yīng)15 min，添加400 μl細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用Cell Quest軟件分析各組MH7A細(xì)胞凋亡率。

1.7 Transwell檢測(cè) 各組MH7A細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入胰酶進(jìn)行消化，收集并計(jì)數(shù)約5×104個(gè)細(xì)胞，使用200 μl不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加到Transwell小室的上室，并于下室添加500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，繼續(xù)孵育24 h。PBS洗滌3次，添加4%多聚甲醛固定30 min，用棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，洗滌后晾干，顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)的多少反映細(xì)胞遷移能力的大小。

1.8 Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后各組MH7A細(xì)胞采用RIPA裂解液裂解，抽提總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白與上樣緩沖液混合，沸水浴致蛋白變性，取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后在封閉液中封阻2 h。洗膜后加入相應(yīng)稀釋的單抗(PCNA 1∶800稀釋，Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9 1∶500稀釋)，4℃孵育15 h，洗膜，再加入二抗(1∶3 000稀釋)，孵育2 h，采用ECL顯色液，采用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，GAPDH標(biāo)定，以Imag J軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算PCNA、Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，擴(kuò)增miR-16-5p結(jié)合位點(diǎn)的hsa_circ_0000734野生型(hsa_circ_0000734-Wt)和突變型(hsa_circ_0000734-Mut)熒光素酶報(bào)告載體，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將重組載體質(zhì)粒分別與miR-16-5p mimics或mimics control共轉(zhuǎn)染MH7A細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別收集各組細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)分析海腎熒光素酶活性和螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，計(jì)算MH7A細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0000734和miR-16-5p在3組MH7A細(xì)胞中的表達(dá) 與Mock組和NC組比較，hsa_circ_0000734組細(xì)胞中hsa_circ_0000734的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-16-5p的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Mock組和NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 hsa_circ_0000734和miR-16-5p在3組細(xì)胞中的表達(dá)水平比較

2.2 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734對(duì)MH7A細(xì)胞增殖能力的影響 與Mock組和NC組比較，hsa_circ_0000734組細(xì)胞增殖活力和PCNA的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；Mock組和NC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 Western blot檢測(cè)PCNA的表達(dá)水平

表2 3組MH7A細(xì)胞增殖活力和PCNA表達(dá)水平比較

2.3 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734對(duì)MH7A細(xì)胞凋亡的影響 與Mock組和NC組比較，hsa_circ_0000734組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；Mock組和NC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 3組MH7A細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平比較

圖2 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734對(duì)MH7A細(xì)胞凋亡的影響；A Western blot檢測(cè)Cleaved Caspase-3的表達(dá)；B AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)MH7A細(xì)胞凋亡率

2.4 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734對(duì)MH7A細(xì)胞遷移能力的影響 與Mock組和NC組比較，hsa_circ_0000734組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Mock組和NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4，圖3。

表4 3組遷移細(xì)胞數(shù)、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平比較

圖3 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734對(duì)MH7A細(xì)胞遷移能力的影響；A Western blot檢測(cè)各組MH7A細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)；B Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組MH7A細(xì)胞遷移能力(結(jié)晶紫染色×100)

2.5 hsa_circ_0000734和miR-16-5p靶向關(guān)系驗(yàn)證 生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析hsa_circ_0000734和miR-16-5p的靶向結(jié)合關(guān)系，在線數(shù)據(jù)庫(kù)Starbase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000734和miR-16-5p之間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-16-5p組hsa_circ_0000734-Wt細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而hsa_circ_0000734-Mut細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 Starbase預(yù)測(cè)hsa_circ_0000734和miR-16-5p結(jié)合位點(diǎn)示意圖

表5 3組MH7A細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性比較

2.6 過(guò)表達(dá)miR-16-5p對(duì)MH7A細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響 采用共轉(zhuǎn)染同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-16-5p和hsa_circ_0000734，與hsa_circ_0000734組比較，miR-16-5p+hsa_circ_0000734組MH7A細(xì)胞中miR-16-5p的表達(dá)和細(xì)胞增殖活力明顯升高，遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 2組細(xì)胞miR-16-5p的表達(dá)、增殖活力、凋亡和遷移能力比較

3 討論

RA是一種病因不明的全身性自身免疫性疾病，其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷、殘疾。以往研究表明，位于滑膜內(nèi)膜邊緣的成纖維樣滑膜細(xì)胞在RA的病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用[9]。據(jù)報(bào)道，滑膜成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有相似的特性，例如，它們可以經(jīng)歷腫瘤樣增殖、侵襲、遷移和抗凋亡[10]?；こ衫w維細(xì)胞可以遷移到未受影響的關(guān)節(jié)，附著在軟骨和骨上，并侵入細(xì)胞外基質(zhì)。因此，滑膜成纖維細(xì)胞無(wú)疑是關(guān)節(jié)炎破壞向遠(yuǎn)關(guān)節(jié)擴(kuò)散的重要因素[11]。抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能夠抑制RA的發(fā)展。MH7A是滑膜成纖維細(xì)胞的一種，常用于RA發(fā)病機(jī)制的研究[12,13]。因此，本研究選擇了MH7A細(xì)胞作為材料。

在過(guò)去的幾十年里，人們對(duì)RA的分子機(jī)制進(jìn)行了大量的探索，然而，以往的研究大多集中在編碼蛋白質(zhì)的基因上。近年來(lái)的證據(jù)表明，盡管非編碼RNA不直接編碼蛋白質(zhì)，但它們?cè)诘鞍踪|(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯中起著調(diào)節(jié)作用[14,15]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，circRNA廣泛參與各種生理和病理過(guò)程，包括許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括腫瘤和自身免疫性疾病等[16]。circRNA是真核生物中豐富的保守內(nèi)源生物分子，具有組織特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)模式。環(huán)狀RNA水平的調(diào)節(jié)可導(dǎo)致多種分子和生理變異，研究人員在RA方面開(kāi)展了一些工作，例如識(shí)別新的生物標(biāo)志物或探索特定circRNA的功能[17]。然而，關(guān)于RA中circRNA的機(jī)制的細(xì)節(jié)仍不清楚。最近的一些研究表明，外周血單個(gè)核細(xì)胞中的hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566、hsa_circ_0003972和hsa_circ_0008360等參與了RA的發(fā)病機(jī)制，可以通過(guò)微陣列分析作為RA的潛在生物標(biāo)志物，并且hsa_circ_0000734的表達(dá)明顯下調(diào)[8]。然而，hsa_circ_0000734在RA中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734能夠明顯抑制MH7A細(xì)胞增殖活力和遷移細(xì)胞數(shù)，并且提高細(xì)胞凋亡率。此外，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734的MH7A細(xì)胞中與增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)明顯降低，與凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯升高。同時(shí)，滑膜成纖維細(xì)胞還可以自發(fā)分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶(包括MMP-2和MMP-9)，在關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞中發(fā)揮重要作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734的MH7A細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯降低。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0000734能夠有效抑制MH7A細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

眾所周知，circRNA通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，包括染色質(zhì)修飾、剪接等。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，circRNA可能通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)在RA中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用[20]。例如，miR-152通過(guò)靶向ADAM10抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。miR-338-5p通過(guò)靶向ADAMTS-9抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖和侵襲[22]。RA患者血清miR-16-5p水平高于健康對(duì)照組，提示miR-16-5p不僅可以作為RA的生物標(biāo)志物，而且可以為RA的病理生理學(xué)研究提供更多的線索[23]。本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000734和miR-16-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示二者可能存在靶向關(guān)系，后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa_circ_0000734能夠靶向調(diào)控miR-16-5p的表達(dá)。因此，本研究構(gòu)建了一個(gè)circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)探究circRNA在RA中的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p模擬物可以拯救hsa_circ_0000734的促進(jìn)功能。從機(jī)制上講，hsa_circ_0000734通過(guò)充當(dāng)miR-16-5p的海綿來(lái)促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0000734可能是RA進(jìn)程中的關(guān)鍵circRNA。