基于閉環(huán)回路氣提法的吸煙者唾液成分分析

周 妍，吳秉宇，費 婷，王 亮，吳 達，劉百戰(zhàn)

上海煙草集團有限責任公司技術中心，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733 號 201315

口腔是感受卷煙煙氣的重要器官。卷煙抽吸過程中，部分煙氣溶解到唾液中，再傳輸?shù)轿独俚瓤谇桓惺芷鞅砻?，與其感官神經(jīng)發(fā)生作用，產(chǎn)生不同、多樣的抽吸感知。相較于采用吸煙機捕集主流煙氣方式進行評價［1-3］，吸煙者唾液中的煙氣成分更貼近與感官接觸的實際煙氣成分，與卷煙品質風格的關系也更為密切。通過研究吸煙者的唾液成分，可進一步明晰影響吸煙者抽吸感受的關鍵煙氣成分。目前，唾液分析在藥物［4-5］、類激素［6］、蛋白組學［7-8］及毒品檢測［9-10］等方面已有較廣泛的應用。但關于吸煙者唾液的研究較少，且多采用模擬方式進行研究。崔楊等［11］應用人工唾液（ISO/TR10271）［12］取代劍橋濾片捕集煙氣成分，該方法穩(wěn)定可靠，捕集的煙氣與吸煙者口腔煙氣更加接近。李軍［13］設計了一種模擬人體感覺器官吸收卷煙主流煙氣的裝置，使用人工唾液作為仿生液，鑒定出部分對卷煙感官品質有重要作用的香氣和香味物質。上述方法仍采用機器機械式吸煙，與消費者實際吸煙行為存在較大差異，且人工唾液與真實唾液仍有一定差距。在真實唾液分析方面，司曉喜等［14］使用Salivette?采樣管收集吸煙者唾液，經(jīng)溶劑萃取及吸附劑分散固相萃取凈化后，采用氣相色譜-飛行時間質譜法僅分析了9種吡啶類和吡嗪類化合物。FEI 等［15］采用純凈水漱口方式采集口腔液體，開發(fā)了吸煙者口腔液體中煙氣成分的固相萃取-中心切割二維氣相色譜-質譜聯(lián)用分析方法，分析了約100種煙氣香味成分。上述方法為滿足唾液復雜基質中低質量分數(shù)成分的分析需求，均采用固相萃取技術和特殊分析儀器，前處理較為繁瑣，效率較低。因此，本研究中改進并優(yōu)化了閉環(huán)回路氣提分析（Closed loop stripping analysis，CLSA）法，對唾液中揮發(fā)、半揮發(fā)性成分進行高效富集，開發(fā)了吸煙者唾液成分的閉環(huán)回路氣提-熱脫附-氣質聯(lián)用分析方法，實現(xiàn)了吸煙者唾液中200余種不同化合物的有效分析，并采用該方法對吸煙者唾液與主流煙氣成分的差異以及不同類型卷煙吸煙者唾液成分的差異性進行了研究，旨在為深化研究煙氣化學成分與感官的關系提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

醫(yī)用脫脂棉球（江西維德醫(yī)療器械有限責任公司）；玻璃采樣管（直徑：0.64 cm，長度：8.89 cm，美國Supelco 公司）；成品卷煙（包括6 種中式烤煙型、3 種英式烤煙型和4 種混合型卷煙，市售）；劍橋濾片（44 mm，英國Whatman 公司）；PTFE 濾膜（0.45 μm，美國Agilent 公司）。

TurboMatrix ATD 熱脫附儀（美國Perkin Elmer公司）；7890B/5977A GC-MS 聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；CDS Model 9600采樣管老化裝置（美國CDS Analytical 公司）；SM450 直線型吸煙機（英國Cerulean公司）。

1.2 方法

1.2.1 吸煙者唾液成分收集

吸煙者每天早上9點進行評吸，每次評吸一款卷煙。評吸前需提前用純凈水漱口，連續(xù)抽吸完2支相同卷煙后，采用咀嚼刺激法，將固定質量（350 mg）的棉球放入口腔咀嚼3 min后收集。對每種卷煙收集5位吸煙者的棉球，合并后放入樣品瓶中。為避免吸煙者個體差異引起的化合物成分及質量分數(shù)差異，本實驗中的唾液均采集自同一批吸煙志愿者。

1.2.2 卷煙主流煙氣粒相物收集

將卷煙樣品在溫度（22±2）℃、相對濕度（60±2）%下平衡48 h，使用直線型吸煙機按照ISO 3308 標準方法抽吸卷煙［16］，使用劍橋濾片捕集煙氣，將捕集了煙氣的劍橋濾片放入樣品瓶中，用于CLSA 煙氣分析。

1.2.3 卷煙主流煙氣溶液的制備

采用1.2.2節(jié)的方法，使用劍橋濾片捕集煙氣，將濾片放入樣品瓶后，加入20 mL 超純水，超聲振蕩30 min后，取上清液過PTFE濾膜后得到主流煙氣溶液，用于CLSA的條件優(yōu)化。

1.2.4 閉環(huán)回路氣提法前處理及分析

使用改進的閉環(huán)回路氣提裝置對唾液和劍橋濾片中的煙氣成分進行富集。閉環(huán)回路氣提裝置包括電動隔膜氣泵、長頸樣品瓶、控溫水浴鍋、冷卻水循環(huán)系統(tǒng)、加熱套和玻璃采樣管。如圖1所示，樣品瓶、采樣管與氣泵管道連接為循環(huán)閉環(huán)回路，在樣品瓶的瓶頸部設有冷凝裝置，溫度為4 ℃，同時在采樣管前端設有加熱套，溫度為70 ℃。具體操作：將裝有棉球或劍橋濾片的樣品瓶持續(xù)通過控溫水浴加熱鍋進行加熱，加熱溫度為70 ℃，并使用電動隔膜氣泵對樣品瓶中的樣品吹掃18 h。使用裝填有200 mg Tenax 吸附劑的玻璃采樣管富集吹掃所得空氣中的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分。富集完成后，取下玻璃采樣管，使用熱脫附-GC-MS技術進行分析。分析條件：

圖1 改進后的閉環(huán)回路氣提裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of modified closed loop stripping analysis system

（1）熱脫附儀條件。一級脫附溫度：270 ℃；一級脫附時間：10 min；二級脫附溫度：280 ℃；二級脫附時間：8 min；閥溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；唾液樣品分流比9∶1；主流煙氣樣品分流比：99∶1。

（2）GC-MS 條件。色譜柱：DB-WAX 毛細管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（≥99.999%）；恒流模式流速：2.0 mL/min；升溫程序：40 ℃（5 min）230 ℃（10 min）。接口溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；EI 源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質量掃描范圍：33～300 amu；采用提取離子法積分峰面積，得到煙氣成分的半定量結果。

1.3 化合物的定性及半定量分析

檢索NIST圖譜數(shù)據(jù)庫對化合物進行定性識別，對匹配度達到90%以上的色譜峰進行定性。

采用提取離子法對色譜峰進行積分得到各化合物的峰面積，作為各揮發(fā)和半揮發(fā)性成分的半定量分析結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用ChemPattern 軟件進行偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），以VIP＞1為差異性化學成分。

2 結果與討論

2.1 閉環(huán)回路氣提系統(tǒng)的改進

目前，閉環(huán)回路氣提法因其靈敏度高、可測范圍寬、設備組裝簡單、成本低廉等優(yōu)點在天然產(chǎn)物及煙草制品揮發(fā)性成分分析中均有應用，如鄔帥帆等［17］采用閉環(huán)回路氣提法進行了不同香型、產(chǎn)地煙葉中揮發(fā)、半揮發(fā)性成分的指紋圖譜研究。但傳統(tǒng)的閉環(huán)回路氣提系統(tǒng)的分析對象主要是煙草等天然產(chǎn)物，對于唾液這種含水量高的樣品，吸附劑易受到冷凝水的干擾，影響揮發(fā)、半揮發(fā)性成分的富集效果。因此，需要針對唾液樣品含水量高、基質復雜、揮發(fā)性成分種類多且濃度低的特點，針對性地開發(fā)適用于唾液樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分的分析方法。

本研究中對現(xiàn)有的CLSA 系統(tǒng)進行了改進和優(yōu)化（圖1）。通過在自制長頸樣品瓶外增加冷凝裝置，使樣品中的水蒸氣冷凝回流至樣品瓶中；并在玻璃采樣管前端增加加熱模塊，能有效避免水蒸氣在吸附劑上冷凝而影響吸附劑的性能，從而提高唾液樣品中揮發(fā)、半揮發(fā)性成分的富集效果，實現(xiàn)對含水量高、基質復雜的樣品中微量揮發(fā)性成分的分析。此外，揮發(fā)和半揮發(fā)性成分富集于采樣管中的吸附劑上，可直接進行熱脫附-GC-MS分析，無需化學溶劑萃取前處理，操作更為簡便快捷。

2.2 CLSA樣品加熱溫度優(yōu)化

將滴加2 mL 主流煙氣成分溶液的棉球作為模擬唾液樣品，置于富集裝置的樣品瓶中，對CLSA的樣品加熱溫度進行優(yōu)化。分別考察了不同CLSA樣品加熱溫度（60、70、80 ℃）對化合物峰面積的影響，以幾種不同類型、不同沸點的揮發(fā)性成分為例（下同），各化合物的色譜峰面積的變化情況如圖2 所示。加熱溫度為70 ℃時，化合物峰面積較60 ℃時明顯增大，整體富集效果較好；加熱溫度80 ℃與70 ℃相比，峰面積變化不大，部分化合物的峰面積略有減小。因此，確定CLSA 的樣品加熱溫度為70 ℃。

圖2 CLSA樣品加熱溫度對化合物響應的影響Fig.2 Effects of CLSA sample heating temperature on compound responses

2.3 CLSA樣品吹掃時間優(yōu)化

與2.2 節(jié)相同，采用模擬唾液樣品考察不同CLSA 樣品吹掃時間（12、18、24 h）對化合物峰面積的影響，部分化合物的結果如圖3所示?？芍瑯悠反祾?8 h條件下，整體富集效果較好；當吹掃時間增至24 h，化合物響應提升不明顯甚至部分略有下降。綜上所述，確定CLSA的樣品吹掃時間為18 h。

圖3 CLSA樣品吹掃時間對化合物響應的影響Fig.3 Effects of CLSA sample purging time on compound responses

2.4 分析方法驗證

采用模擬唾液樣品對所建立的分析方法進行精密度考察。由于檢測到的化合物較多，表1中僅列舉了部分化合物峰面積的精密度結果?？芍⒌姆椒ǚ€(wěn)定性良好，能夠滿足吸煙者唾液成分的分析要求。

表1 方法的精密度（n=5）Tab.1 Accuracies of the method（n=5）

應用所建方法對唾液樣品進行分析，色譜圖基線低、峰型較好，對水基樣品中的揮發(fā)、半揮發(fā)性成分具有良好富集效果。將不同類型卷煙的唾液樣品進行混合，分別平行檢測5次，共檢出能夠準確定性且峰面積RSD≤20%的226種不同種類的化學成分，其中，芳香族53種，酮類52種，氮雜環(huán)39種，醛類18種，醇類14種，酸類13種，烯烴類11種，酯類8種，氧雜環(huán)類6種，生物堿類4種，其他類化合物8種。

2.5 吸煙者唾液與主流煙氣中的成分比較

應用所建立的分析方法分別對卷煙主流煙氣粒相物和吸煙者唾液中的揮發(fā)、半揮發(fā)性成分進行分析，以煙堿為基準，分別考察煙氣和唾液中各類成分與煙堿的色譜峰面積的比值，比較煙氣和唾液中幾類關注成分的組成及質量分數(shù)的變化情況，主要包括吡啶類、吡嗪類、呋喃類、環(huán)戊酮類、環(huán)戊烯酮類、環(huán)戊烯醇酮類、烯烴類、內酯類、酚類和中性香味成分以及三乙酸甘油酯。

2.5.1 主流煙氣和吸煙者唾液中化合物各自與煙堿的色譜峰面積的比值

主流煙氣和吸煙者唾液中化合物各自與煙堿的色譜峰面積的比值如圖4所示。結果顯示：相較于主流煙氣，吸煙者唾液中的成分組成發(fā)生了較大變化。主流煙氣中色譜峰面積較大的成分為酚類化合物和三乙酸甘油酯，峰面積較小的為中性香味成分以及吡嗪類、內酯類和環(huán)戊酮類化合物；唾液中峰面積較大的成分為酚類、環(huán)戊烯酮類、呋喃類、吡啶類和吡嗪類化合物，峰面積較小的成分為三乙酸甘油酯以及環(huán)戊烯醇酮類和內酯類化合物。煙氣中色譜峰面積較大的三乙酸甘油酯在唾液中峰面積則較??；煙氣中峰面積較小的吡嗪類化合物，在唾液中峰面積則較大；相較于主流煙氣，環(huán)戊烯酮類、呋喃類和吡啶類化合物在唾液中的峰面積也明顯增大。

圖4 主流煙氣和吸煙者唾液中化合物各自與煙堿的色譜峰面積的比值Fig.4 Ratios of chromatograph peak areas of compounds to nicotine in mainstream cigarette smoke and saliva samples

2.5.2 吸煙者唾液中各類化合物與煙堿色譜峰面積的比值相較于主流煙氣的變化程度

唾液中各類化合物與煙堿色譜峰面積的比值和主流煙氣中各類化合物與煙堿色譜峰面積的比值的對比結果如圖5所示。結果表明：相較于主流煙氣，唾液中不同種類化合物的變化程度差異明顯。其中，變化最為顯著的是環(huán)戊酮類、吡嗪類和內酯類化合物以及三乙酸甘油酯，相較于主流煙氣，唾液中環(huán)戊酮類和吡嗪類化合物的色譜峰面積與煙堿的比值升高達10～30 倍，內酯類化合物和三乙酸甘油酯與煙堿的比值則降低了95%以上。環(huán)戊烯酮類、吡啶類及呋喃類化合物的色譜峰面積與煙堿的比值相對于煙氣升高了5倍左右。中性香味成分以及酚類、烯烴類和環(huán)戊烯醇酮類化合物則變化幅度相對較小，相較于主流煙氣，唾液中中性香味成分和酚類化合物的色譜峰面積與煙堿的比值升高2倍左右，烯烴類和環(huán)戊烯醇酮類化合物則降低50%左右。煙氣成分在唾液中組成比例的變化，可能與物質的親水程度有關。

圖5 吸煙者唾液與主流煙氣各類成分對比Fig.5 Comparison of compositions in cigarette smoker’s saliva samples and mainstream cigarette smoke

通過上述各類化合物比例的變化可以看出，吸煙機捕集的主流煙氣和吸煙者口腔唾液中的化合物組成及比例存在明顯差異，這可能是由于吸煙機標準抽吸模式與志愿者的實際抽吸方式存在一定差異，以及唾液對不同類型化合物保留能力的差異導致的。該結果進一步說明對吸煙者唾液中煙氣成分的分析更能客觀真實地反映卷煙的感官品質。

2.6 不同類型卷煙吸煙者唾液成分比較

使用所建立的方法對不同類型卷煙樣品吸煙者唾液成分進行分析，數(shù)理統(tǒng)計結果表明，不同類型卷煙吸煙者唾液成分存在明顯差異（圖6）。不同類型卷煙吸煙者唾液的差異性成分主要有47種，差異較大的主要為吡啶類、吡嗪類、環(huán)戊烯酮類和呋喃類化合物。對不同類型卷煙吸煙者唾液與主流煙氣差異成分進行比較，結果（表2）表明，主流煙氣差異成分與吸煙者唾液中差異成分有明顯區(qū)別。

圖6 不同類型卷煙吸煙者唾液的OPLS-DA散點圖Fig.6 OPLS-DA scatter diagram of saliva of smokers smoking different type cigarettes

表2 不同類型卷煙吸煙者唾液與主流煙氣差異成分比較Tab.2 Main different components in saliva of smokers smoking different type cigarettes and mainstream cigarette smoke

對不同類型卷煙吸煙者唾液樣品中差異成分的色譜峰面積進行比較（圖7），結果表明：①英式烤煙和混合型卷煙吸煙者唾液中吡啶類和吡嗪類成分總體高于中式烤煙型，這與其配方中晾曬煙的使用有關［18］；②中式烤煙型卷煙吸煙者唾液中環(huán)戊烯酮類和呋喃類成分總體高于英式烤煙和混合型卷煙，這可能是因為中式烤煙型卷煙中糖的質量分數(shù)較高［18］。

圖7 不同類型卷煙吸煙者唾液差異性成分色譜響應比較Fig.7 Chromatograph responses of characteristic compositions in saliva of smokers smoking different type cigarettes

3 結論

（1）建立的閉環(huán)回路氣提-熱脫附-氣質聯(lián)用分析方法，對吸煙者唾液樣品中揮發(fā)、半揮發(fā)性成分具有良好的富集作用，可檢出226 種成分，且精密度良好。

（2）相較于主流煙氣，唾液中不同種類化合物的組成以及比例發(fā)生了明顯變化，其中，變化最為顯著的是環(huán)戊酮類、吡嗪類和內酯類化合物以及三乙酸甘油酯，環(huán)戊酮類和吡嗪類化合物的色譜峰面積與煙堿的比值顯著升高，而內酯類化合物和三乙酸甘油酯的色譜峰面積與煙堿的比值顯著降低。

（3）不同類型卷煙吸煙者唾液的主要化合物有明顯區(qū)別，英式烤煙和混合型卷煙吸煙者唾液中吡啶類和吡嗪類化合物的色譜峰面積高于中式烤煙型，中式烤煙型卷煙吸煙者唾液中環(huán)戊烯酮類和呋喃類化合物的色譜峰面積則高于英式烤煙和混合型卷煙。