一例鴨疫里默氏菌病的診斷

王秀禎 林志敏 林彬彬 謝碧林 翁漢東 莆田市農業(yè)科學研究所 福建莆田 351100

由鴨疫里默氏菌引起的鴨病稱為鴨傳染性漿膜炎。該病又名鴨疫巴氏桿菌病、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征等[1]，以敗血癥多見，以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎為主要臨床特征[2]，部分病例還出現干酪樣輸卵管炎、結膜炎、關節(jié)炎等特征。鴨疫里默氏菌主要感染1～8周齡鴨，病亡率可達75%，是養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的傳染病之一[3]。

2022年3月，莆田市荔城區(qū)某鴨場送檢6羽雛番鴨，臨床癥狀表現為精神沉郁、腿軟無力、顫抖怕冷，眼渾濁、鼻有黏液性分泌物流出，排白色水樣稀糞，瀕臨死亡時鴨不停甩頭、抽搐，仰臥作劃水狀。病例解剖發(fā)現心臟、氣囊有大量纖維素性滲出物附著，肝脾腫大、有壞死灶。根據臨床癥狀和解剖病理特征初步診斷為鴨疫里默氏菌病，為進一步確診，進行實驗室檢測和藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 病料采集 無菌采集莆田市荔城區(qū)某鴨場患鴨的心臟、肝臟、脾臟。

1.2 主要試劑與儀器TSA培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker均為天根生化科技有限公司產品，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為OMEGA公司產品，藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產品。恒溫培養(yǎng)箱，CO2培養(yǎng)箱，恒溫搖床，離心機，PCR擴增儀，電泳儀、電泳槽，凝膠分析成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離培養(yǎng) 將無菌采集病料的心臟、肝臟、脾臟劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、含5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中、TSA培養(yǎng)基置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況。挑取單個菌落接種于5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，進行純培養(yǎng)。

1.3.2 鏡檢 挑取TSA培養(yǎng)基上的單個菌落涂片，進行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 PCR鑒定 挑取TSA培養(yǎng)基上的單個菌落進行PCR鑒定，用水煮法提取細菌DNA作為模板，引物為參考文獻[7]的鴨疫里默氏菌外膜蛋白OmpA基因引物（上游引物：ACTCAAGGAAGAGCGGATCA，下游引物：GCTTCAGCAGAACCAACTCC），預期擴增片段為809 bp。反應體系及反應條件見表1-表2。取擴增產物10 μL經1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀上觀察結果，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的DNA，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI上進行Blast比對。

表1 PCR反應體系（20 μL體系）

表2 PCR反應條件

1.4 藥敏試驗 藥敏試驗采用K-B紙片法。取100 μL分離菌純培養(yǎng)液于5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，用涂抹棒將菌液涂布均勻，待菌液干燥后將藥敏紙片有序放置，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，觀察測量抑菌圈直徑并記錄結果。

2 結 果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果 分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上不生長，在5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上生長出圓形、灰白色、表面光滑、直徑約1 mm的菌落，符合鴨疫里默氏菌的菌落特征。

2.2 鏡檢結果 經革蘭氏染色后，鏡檢顯示菌體呈革蘭氏陰性短小桿菌。

2.3 PCR鑒定結果PCR擴增產物電泳結果見圖1，檢測菌目的條帶位于750～1 000 bp，與預期擴增片段大小一致。PCR產物測序后，經Blast分析比對，與鴨疫里默氏菌OmpA基因序列的相似性為99.6%，確定該分離菌為鴨疫里默氏菌。

圖1 鴨疫里默氏菌OmpA基因PCR擴增

2.4 藥敏試驗結果 根據抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準（CLSI）中的判斷標準進行判斷，分離菌對14種抗菌藥物的敏感試驗結果見表3。分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、強力環(huán)素、氟苯尼考敏感，對恩諾沙星中度敏感，對硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、阿米卡星、紅霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、多粘菌素耐藥。

表3 鴨疫里默氏菌藥敏試驗結果

3 小結與討論

通過細菌分離培養(yǎng)、鏡檢、PCR檢測，確定該分離菌為鴨疫里默氏菌。藥敏試驗發(fā)現，該分離菌對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、強力環(huán)素、氟苯尼考敏感，對恩諾沙星中度敏感，對硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、阿米卡星、紅霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、多粘菌素耐藥，該結果對臨床上指導用藥有幫助。

鴨疫里默氏菌血清型眾多，目前世界上公認的血清型有21種，且出現了一些未鑒定的血清型[4-7]，各血清型間缺乏交叉免疫保護，給疫苗免疫預防帶來困難。在臨床上對該病大多采用抗生素進行治療，但由于大量抗生素的濫用，造成鴨疫里默氏菌的耐藥性不斷增強。因此，及時選擇合適的敏感藥物進行對癥治療至關重要。建議莆田市荔城區(qū)該鴨場選擇氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、強力環(huán)素、氟苯尼考等藥物進行治療。同時，鴨場要做好防控工作，定期做好消毒和防疫措施，交替使用消毒藥物以避免產生耐藥性，做好禽流感、鴨瘟等疫病的免疫工作，并及時跟蹤免疫抗體監(jiān)測；改善鴨場飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生條件，注意飼養(yǎng)密度、通風、干燥、溫度，減少應激、勤換墊料等。