一例番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌共感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

謝碧林 林志敏 林彬彬 翁漢東 莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建莆田 351100

隨著番鴨養(yǎng)殖行業(yè)不斷發(fā)展壯大，水禽疫病也呈現(xiàn)出日益復(fù)雜的態(tài)勢。番鴨呼腸孤病毒病的主要特征是軟腳，剖檢見肝臟和脾臟出現(xiàn)小白點(diǎn)，腎臟腫大、出血，俗稱番鴨“肝白點(diǎn)病”、“花肝病”[1-2]。鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏菌引起的一種接觸性傳染性疾病，感染鴨有明顯的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎等病變[3]。

2021年11月，本所實(shí)驗(yàn)室接診一例來自莆田市荔城區(qū)某雛番鴨養(yǎng)殖戶的病例。該養(yǎng)殖戶共有4個鴨舍，存欄6 000多羽雛番鴨，采用雙層網(wǎng)上平養(yǎng)養(yǎng)殖模式。22日齡時，其中1個鴨舍開始發(fā)病，每日約有40羽死亡，患鴨精神萎靡，食欲不振，腿軟不愿意走動，部分鴨出現(xiàn)站立不穩(wěn)，頭歪轉(zhuǎn)圈等共濟(jì)失調(diào)癥狀。鴨舍通風(fēng)不良，氨味濃。剖檢病死鴨，可見心臟布滿白色纖維素滲出物，脾臟有大量白色點(diǎn)狀壞死，胰腺表面散布白色壞死點(diǎn)，腎臟腫大。根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變及實(shí)驗(yàn)室分離檢測結(jié)果，確診為番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌共感染病例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料組織 病料無菌采自莆田市荔城區(qū)某雛番鴨養(yǎng)殖戶疑似感染番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌的22日齡病死番鴨的肝臟、脾臟、胰腺、腎臟和腦等病變組織。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）、麥康凱瓊脂、藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GeneRed核酸染料，購自天根生化科技有限公司；第一鏈cDNA合成Master Mix、柱式病毒RNA抽提純化試劑盒、Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 參照文獻(xiàn)[4-10]合成鴨疫里默氏菌外膜蛋白A基因（OmpA）引物及番鴨呼腸孤病毒、鴨甲肝病毒、番鴨細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒、鴨瘟病毒、新型鴨呼腸孤病毒、鴨腺病毒2型、鴨腺病毒3型等病毒檢測引物。鴨疫里默氏菌外膜蛋白A基因（OmpA）及番鴨呼腸孤病毒檢測引物見表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 部分檢測引物序列及相關(guān)參數(shù)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌的分離純化 無菌挑取病死番鴨腦組織，分別劃線接種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基及加入2%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基，TSA培養(yǎng)基平板放入燭缸，與麥康凱培養(yǎng)基一起置于37℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.2.1.2 細(xì)菌PCR檢測 挑取純培養(yǎng)菌落于50 μL ddH2O中，吹打混勻，沸水浴5 min，自然冷卻后5 000 r/min離心5 min，取上清作為模板進(jìn)行PCR檢測，同時以ddH2O作為空白對照。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序：96℃預(yù) 變 性5 min，94℃變 性1 min，60℃退 火50 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行Blast分析。

1.2.1.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）的要求，通過紙片擴(kuò)散法對分離菌株進(jìn)行抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 常見病毒PCR檢測 取適量病死番鴨病變組織，加入4倍量滅菌生理鹽水研磨、勻漿，反復(fù)凍融3次，離心取上清，按照試劑盒說明書的要求提取病毒核酸，DNA存-20℃，RNA反轉(zhuǎn)錄后存-20℃?zhèn)溆谩７謩e對上述樣品按照文獻(xiàn)[5-10]對疑似疫病病原（鴨甲肝病毒、番鴨細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒、番鴨呼腸孤病毒、新型鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨腺病毒2型和3型）開展（RT-）PCR檢測，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行Blast分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

2.1.1 細(xì)菌分離結(jié)果 病死番鴨腦組織病料經(jīng)細(xì)菌純化培養(yǎng)，在麥康凱瓊脂平板上未見細(xì)菌生長；在TSA平板上可見直徑約1.5 mm、表面光滑、圓形稍隆起、邊緣整齊的菌落，斜射光觀察可見菌落呈淡藍(lán)色，挑取典型單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.1.2 細(xì)菌PCR檢測結(jié)果PCR擴(kuò)增得到的片段大小為809 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。將PCR產(chǎn)物送生物公司測序，測序結(jié)果在NCBI上Blast分析，結(jié)果顯示，與鴨疫里默氏菌OmpA基因序列的同源性為100%。

圖1 細(xì)菌、病毒PCR擴(kuò)增檢測情況

2.1.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（見表2），該鴨疫里默氏菌分離株對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考等藥物高度敏感；對青霉素G、恩諾沙星中度敏感；對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、多粘菌素等藥物耐藥。

表2 鴨疫里默氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 病毒PCR檢測結(jié)果 病毒PCR擴(kuò)增顯示，只有番鴨呼腸孤病毒擴(kuò)增得到300 bp目的條帶，其他病毒檢測均未擴(kuò)增出目的條帶（見圖1）。將以上PCR產(chǎn)物送生物公司測序后進(jìn)行堿基序列比對，結(jié)果顯示送檢的PCR產(chǎn)物樣品基因序列與GenBank中鴨呼腸孤病毒HP080421株的S2基因序列（登錄號為JX852431.1）同源性為98%。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合發(fā)病番鴨的臨床癥狀、剖檢情況和實(shí)驗(yàn)室病原檢測結(jié)果，確定該病例為番鴨呼腸孤病毒與鴨疫里默氏菌共感染。

番鴨呼腸孤病毒病是由番鴨呼腸孤病毒引起的，國內(nèi)胡奇林等[11]于2000年首次報道，隨后吳寶成等[1]分離出該病毒，并鑒定為呼腸孤病毒。該病的主要病理表現(xiàn)為肝、脾表面分布有大量白點(diǎn)，腎臟出血、腫大。番鴨呼腸孤病毒感染通常有脾臟受損的現(xiàn)象，易引起其功能失常而致免疫抑制[12]，進(jìn)而易繼發(fā)大腸桿菌病[13]或鴨疫里默氏菌病[14]等細(xì)菌病。鴨疫里默氏菌是當(dāng)前危害番鴨養(yǎng)殖的重要細(xì)菌病原之一，給番鴨養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

當(dāng)前，番鴨養(yǎng)殖面臨著復(fù)雜的生存環(huán)境，動物疫病對番鴨養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越突出，診療的費(fèi)用提升了番鴨的養(yǎng)殖成本。因此，減少診療的支出將是提高養(yǎng)殖利潤的途徑之一。在當(dāng)前限抗和無抗養(yǎng)殖的背景下，動物疫病防控應(yīng)當(dāng)遵循“預(yù)防為主，防重于治”的方針，養(yǎng)殖戶須積極主動做好疫苗防疫規(guī)劃工作，化被動為主動，提高番鴨自身抵抗病原菌侵染的能力。

疫苗仍然是防控疫病的首選。據(jù)了解，莆田地區(qū)的孵化場，出雛當(dāng)日均為其注射了番鴨呼腸孤病毒病疫苗，為該病的預(yù)防提供了一定的基礎(chǔ)，現(xiàn)暫未發(fā)現(xiàn)該病大規(guī)模流行。

為提升動物疫病診斷準(zhǔn)確性，對分離的細(xì)菌應(yīng)進(jìn)行血清分型和藥物敏感性試驗(yàn)，做到有的放矢，避免因使用對病原不敏感的藥物而造成浪費(fèi)。在疫病防控過程中，生物安全措施發(fā)揮著重要的作用，而部分養(yǎng)殖業(yè)主特別是散養(yǎng)戶觀念相對落后，對番鴨養(yǎng)殖環(huán)境的生物安全措施重視程度不夠，因此造成慘痛的經(jīng)濟(jì)損失。動物疫病診療從業(yè)者應(yīng)積極引導(dǎo)，普及更新養(yǎng)殖業(yè)主的專業(yè)知識，提升動物福利。