不同氟苯尼考制劑在日本鰻鱺體內(nèi)的代謝及消除規(guī)律

李惠靜 李忠琴 莊若飛 林章秀 羅 琳 李 莉

（1.廈門惠盈動物藥業(yè)有限公司 福建廈門 361023；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心 福建廈門 361021；3.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 福建廈門 361021）

我國鰻鱺養(yǎng)殖已有多年歷史，是世界上最大的鰻鱺生產(chǎn)國[1]。鰻鱺的常見疾病以細(xì)菌性疾病危害最為嚴(yán)重。據(jù)報道，鰻鱺細(xì)菌性疾病的病原主要以氣單胞菌、假單胞菌、鰻弧菌、愛德華氏菌及柱狀屈橈桿菌為主[2-6]。針對鰻鱺細(xì)菌性疾病的治療，目前多數(shù)采用化學(xué)制劑類和抗生素類藥物[4-7]。氟苯尼考，又叫氟甲砜霉素，其結(jié)構(gòu)中磺酰甲基取代氯霉素的-NO2基團(tuán)，避免了潛在的骨髓抑制或再生障礙性貧血等危害，可用于防治鰻弧菌 （Vibrio anguillarum）、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）等引起的疾病[8]。《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）指出，可以用于水產(chǎn)動物的氟苯尼考制劑有氟苯尼考粉和氟苯尼考注射液[9]，但由于氟苯尼考水溶性差，生物利用度低，限制了其在制劑和臨床上的應(yīng)用。

鰻業(yè)是典型的出口依賴型外向型行業(yè)，鰻鱺產(chǎn)品中的抗生素藥物殘留問題導(dǎo)致的食品質(zhì)量安全問題，嚴(yán)重影響我國鰻鱺出口貿(mào)易及其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10-11]。眾多研究[12-17]均是考察氟苯尼考原料藥在鰻鱺體內(nèi)的代謝規(guī)律，對氟苯尼考制劑的代謝研究相對較少，不同劑型應(yīng)用于鰻鱺時，其體內(nèi)消除呈現(xiàn)不同的規(guī)律。因此本文以氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液為試驗藥品，采用連續(xù)多次口灌日本鰻鱺，檢測其在鰻鱺體內(nèi)各組織（血漿、肝臟、腎臟、肌肉）的含量，解析氟苯尼考在日本鰻鱺各組織內(nèi)的消除規(guī)律，為不同需求提出休藥期建議，為鰻鱺養(yǎng)殖中合理使用氟苯尼考粉劑和液體制劑提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗藥品：氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品（來源中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液（含量以10%氟苯尼考計，來源廈門惠盈動物藥業(yè)有限公司）；肝素鈉、乙腈（HPLC）、冰醋酸（HPLC）、乙酸乙酯、正己烷等均為市售分析純。

試驗動物：日本鰻鱺 （369±58 g），飼養(yǎng)在70 cm×40 cm×40 cm水箱中，水溫控制在25℃左右，暫養(yǎng)10 d后進(jìn)行抽樣，檢測其體內(nèi)無氟苯尼考?xì)埩鬧12]。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法與樣品采集處理[12]將暫養(yǎng)的日本鰻鱺隨機(jī)分為兩組，每組15尾日本鰻鱺，稱取氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液適量，加入不含淀粉的鰻魚飼料，加水配制成含氟苯尼考10 mg/mL的糊狀液，采用多次給藥，連續(xù)5 d，每天1次，按30 mg/kg劑量口灌給藥，將鰻鱺放進(jìn)水中進(jìn)行觀察。期間鰻鱺無回吐現(xiàn)象才繼續(xù)進(jìn)行試驗。

鰻 鱺 分 別 于 給 藥 后 第1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d、20 d、30 d進(jìn)行血液、肝臟、腎臟、肌肉等樣品采集，每個時間點(diǎn)采集5尾，采集的血液樣品在0.1 g/L肝素鈉潤洗風(fēng)干的離心管中，5 000 r/min離心15 min，將上層血漿提取出來置-80℃保存。采集血液后，放血完成，取出肝臟、腎臟和背鰭附近的軸肌，-80℃密封保存。

1.2.2 樣品前處理 血樣處理：取1 mL血漿樣品置于10 mL離心管中，加入2 mL純乙酸乙酯，漩渦振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min，取其上清液于相同規(guī)格PVC管中。重復(fù)該步驟2次，合并上清液。將提取好藥物的PVC管放入氮吹儀，60℃用氮?dú)饬鲹]干，揮干后加入流動相1 mL，渦旋振蕩5 min，超聲波溶解殘留物，直至溶解完全。加入正己烷1.5 mL，渦旋振蕩均勻后離心10 min使其分層，棄去上清液，重復(fù)加入正己烷1次，通過孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，儲存于進(jìn)樣瓶中，放置4℃冰箱備用[8]。

組織樣品處理：肌肉、肝、腎等樣品解凍后剪碎，放入組織勻漿機(jī)打散成泥狀，稱取1 g置于10 mL離心管中，方法同血樣處理。

1.2.3 色譜條件 色譜柱型號為C18（4.0 mm×250 mm，5 μm），柱 溫35℃；紫 外 檢 測 波 長 為223 nm；流動相乙腈:水:冰醋酸（200:797:3），流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 精密稱定氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，加流動相溶解并定量稀釋，制成200 μg/mL氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確移取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn) 儲 備 液，依 次 稀 釋 成100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，過0.22 μm有機(jī)相濾頭后通過HPLC進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.6 樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 使用加入法，在各組織的離心管中分別加入一定量的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使其成為質(zhì)量濃度分別為100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL樣品標(biāo)準(zhǔn)工作液，過0.22 μm有機(jī)相濾頭后通過HPLC進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.7 回收率和精密度測定 每種組織（血漿、肝臟、腎臟、肌肉）取空白組織，制成含0.1、1.0、10.0 μg/mL（以氟苯尼考計）的樣品。按照1.2.2方法制樣，HPLC檢測，計算各組織中的回收率。對上述樣品1 d內(nèi)分5次進(jìn)行測定，每個時間點(diǎn)的濃度重復(fù)測定3次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，每次重復(fù)測定3次，計算日間精密度。

1.3 休藥期計算 利用SPSS20.0軟件對藥時數(shù)據(jù)以一級消除動力學(xué)方程C1=C0e-ket進(jìn)行擬合，獲得消除曲線的縱截距C0和消除速率常數(shù)Ke，消除半衰期t1/2=0.693/ke，休藥期（WDT）=ln（C0/MRL）/Ke，以氟苯尼考MRL為0.2 μg/g計算[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用Excel和SPSS20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 氟苯尼考的色譜分離及最低檢測限 利用液相色譜分析血漿空白樣品、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、添加氟苯尼考的血漿，通過色譜圖（見圖1）可以清晰觀察到，氟苯尼考的特征峰峰型尖銳，保留時間為12.06 min，與其他雜峰能夠很好地分離。以三倍信噪比 （S/N）計算，氟苯尼考的最低檢測限為0.02 μg/mL；其余組織（腎臟、肝臟、肌肉）均與血漿中氟苯尼考色譜圖相似，特征峰譜峰尖銳，分離效果明顯。

圖1 血漿中氟苯尼考色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。結(jié)果表明，在0.05～100 μg/mL范圍線性良好，線性回歸方程為：y=2.939x-0.112，相關(guān)指數(shù)（R2）為0.9999。

圖2 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

血漿中氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y1=2.8486x1-0.2279，R2=0.9991（見圖3）；腎臟中氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y2=2.5125x2-1.6868，R2=0.9975（見圖4）；肝臟中氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y3=3.0808x3-0.5116，R2=0.9990（見圖5）；肌肉中氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y4=2.9238x4-0.2117，R2=0.9997（見圖6）。

圖3 血漿樣品工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 腎臟樣品工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 肝臟樣品工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 肌肉樣品工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 回收率和精密度 本試驗條件下，添加0.1、1.0、10 μg/mL氟苯尼考[13]在血漿中的回收率為98.69%～102.31%、肝臟中的回收率為89.37%～96.37%、腎臟中的回收率為88.64%～95.22%、肌肉中的回收率為83.45%～89.54%，日內(nèi)精密度為0.40%～5.13%，日間精密度為0.36～5.27%（見表1），說明該試驗方法重現(xiàn)性好，精密度高。

表1 氟苯尼考在不同組織中的回收率和精密度

2.4 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鰻鱺體內(nèi)的殘留量 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鰻鱺4種組織中不同采樣時間的殘留濃度見表2-表3，日本鰻鱺經(jīng)多次口灌氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液后，體內(nèi)藥物的消除曲線見圖7?？梢钥闯觯侥峥荚谌毡决狑~體內(nèi)分布較廣，血漿對氟苯尼考的消除是最快的，腎臟的消除是最慢的，肝臟和肌肉對氟苯尼考的消除差異不大；日本鰻鱺應(yīng)用氟苯尼考溶液消除代謝比氟苯尼考粉快；氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在血漿中氟苯尼考第5 d殘留量相對于第1 d的殘留量分別降低30.7%和72.9%，在肝臟中第5 d殘留量相對于第1 d的殘留量分別降低66.9%和69.7%，在腎臟中第5 d殘留量相對于第1 d的殘留量分別降低55.6%和70.9%，在肌肉中第5 d殘留量相對于第1 d的殘留量分別降低57.4%和63.8%。可見，氟苯尼考溶液5 d內(nèi)代謝消除比氟苯尼考粉代謝消除更快。

圖7 氟苯尼考粉和溶液在日本鰻鱺體內(nèi)不同組織的消除曲線

表2 氟苯尼考粉在日本鰻鱺4種組織中的殘留濃度

表3 氟苯尼考溶液在日本鰻鱺4種組織中的殘留濃度

2.5 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鰻鱺體內(nèi)的消除規(guī)律 氟苯尼考粉和溶液在鰻鱺體內(nèi)以一級動力學(xué)方式消除，其消除動力學(xué)參數(shù)及推算的休藥期結(jié)果見表4?？梢钥闯觯侥峥贾瞥煞侥峥挤酆腿芤汉蠖啻慰诠嗳毡决狑~，在其體內(nèi)均能夠進(jìn)行有效消除，氟苯尼考溶液的消除速率比氟苯尼考粉稍快一點(diǎn)；這兩種劑型在鰻鱺的血漿、肝臟、肌肉等部位并沒有較高的殘留現(xiàn)象，腎臟的消除速率會稍慢些。

表4 氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液在日本鰻鱺4種組織中的消除動力學(xué)參數(shù)、休藥期

3 討 論

3.1 不同劑型氟苯尼考的代謝和殘留Horsberg等[14]研究氟苯尼考在大西洋鮭體內(nèi)的代謝和消除規(guī)律，以10 mg/（kg·d）劑量管飼，給藥后56 d，皮膚、肝臟和腎臟仍然能檢測到氟苯尼考?xì)埩?，而在給藥后28 d，血漿和肌肉中已經(jīng)不能檢測到氟苯尼考，肌肉中氟苯尼考的檢出率從90%（6 h）縮減到20%（3 d）。鄭重鶯等[15]研究了氟苯尼考在南美白對蝦體內(nèi)的殘留消除規(guī)律，在血液、肌肉等部位藥物殘留量比較少，給藥后，氟苯尼考濃度均緩慢下降，10 d后血液中的氟苯尼考不能檢出，但肌肉中20 d時仍有低量檢出。陳星星[13]給歐洲鰻鱺按100 mg/kg單劑量口服氟苯尼考，給藥后大部分約1 h達(dá)到峰值，分布迅速而廣泛，吸收半衰期T1/2Ka為3.82±6.40 h。本試驗采用多劑量給藥，連續(xù)5 d，每天1次，按30 mg/kg劑量口灌給藥，可以觀察到口服氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液后，日本鰻鱺吸收迅速，分布廣泛，抗菌活性好，體內(nèi)半衰期較長，殘留小，臨床上可推廣使用。依據(jù)消除規(guī)律分析，氟苯尼考粉在日本鰻鱺血漿、肝臟、腎臟、肌肉中t1/2分別為8.9、6.4、11.2、5.7 d；氟苯尼考溶液在日本鰻鱺血漿、肝臟、腎臟、肌肉中t1/2分別為8.3、6.9、7.5、8.2 d，在血漿和肝臟中無顯著差別，在腎臟和肌肉中半衰期差別較大。林茂等[16]研究了氟苯尼考在兩種鰻鱺體內(nèi)的殘留及消除規(guī)律，在25℃，以30 mg/kg劑量多次口灌給藥后，氟苯尼考在鰻鱺體內(nèi)以一級動力學(xué)方式消除，半衰期t1/2較長，在日本鰻鱺和歐洲鰻鱺血漿中半衰期分別為7.8 d和8.3 d，本研究也是采用在25℃，以30 mg/kg劑量多次口灌給藥應(yīng)用于日本鰻鱺，氟苯尼考粉和溶液在血漿中半衰期分別為8.9 d和8.3 d，氟苯尼考粉比氟苯尼考原藥直接給藥用于日本鰻鱺的半衰期要長，說明藥物作用時間更長；氟苯尼考溶液與氟苯尼考原藥直接給藥用于日本鰻鱺的半衰期相當(dāng)，說明溶液劑型對日本鰻鱺的作用時間沒有因為劑型改變而受到影響。

從本試驗也可以看出，相同給藥劑量的氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液應(yīng)用于日本鰻鱺時，溶液劑型的消除代謝比粉劑劑型更快；不同水產(chǎn)種類、采用不同給藥劑量、采用不同的軟件推算、不同的組織部位有不同的消除規(guī)律。

3.2 不同劑型氟苯尼考的休藥期 農(nóng)業(yè)部第278號公告規(guī)定了氟苯尼考在所有魚類中的休藥期為375℃·d（相當(dāng)于25℃水溫下15 d），未考慮不同魚種類對藥物消除速度的影響。黃聚杰等[17]以60 mg/kg（氟苯尼考）的高劑量單次給藥后，利用WT程序計算的結(jié)果顯示，氟苯尼考在花鱸肌肉、肝、腎和血漿中的理論休藥期分別為6.54、8.69、8.30和5.89 d。余培建等[10]用100 mg/kg濃度口灌給藥后采用PKS軟件對血漿、肌肉、肝臟、腎臟測得的藥物濃度進(jìn)行分析，擬合結(jié)果采用開放性二室模型描述，推算出歐洲鰻鱺對氟苯尼考休藥期為11.6 d。林茂等[12]研究了在25℃下以30 mg/kg多次口灌給藥后，血液殘留較少，以肌肉為食用部位休藥期大于23.2 d，以腎臟為食用部位休藥期應(yīng)大于38.7 d。陳星星[13]給歐洲鰻鱺按100 mg/kg單劑量口服氟苯尼考，血液、肌肉、肝臟代謝過程符合開放型一級吸收二室模型，通過WT1.4計算，休藥期不少于6 d。林茂等[16]以30 mg/kg對兩種鰻鱺口灌給藥后用SPSS 11.0對血漿、肌肉、肝臟、腎臟測得的藥物濃度進(jìn)行分析，擬合結(jié)果采用一級消除動力學(xué)方程進(jìn)行擬合，如規(guī)定最高殘留量為0.2 μg/g，日本鰻鱺和歐洲鰻鱺最大休藥期分別為38.7 d和28.5 d，若只以肌肉為食，最大休藥期為23.2 d和28.0 d；如規(guī)定最高殘留量為1 μg/g，日本鰻鱺和歐洲鰻鱺最大休藥期分別為19.0 d和11.2 d，若只以肌肉為食，最大休藥期為5.2 d和4.3 d。據(jù)本試驗研究結(jié)果，如只以肌肉為食，針對國內(nèi)或歐美市場的日本鰻鱺使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液的休藥期所需時間分別為9.9 d和4.5 d；如以整鰻食用，出口日本的日本鰻鱺使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液休藥期就至少需要分別延長至32.1 d和18.2 d。以日本鰻鱺為研究對象，林茂等[12]研究表明的休藥期比本試驗研究的均更長。因此，還需結(jié)合具體給藥方案、具體食用部位和不同地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)制訂針對性的參考休藥期，以指導(dǎo)氟苯尼考在鰻鱺養(yǎng)殖行業(yè)的合理用藥。

4 結(jié) 論

本研究采用在25℃以30 mg/kg劑量多次口灌給藥應(yīng)用于日本鰻鱺，氟苯尼考粉和溶液在血漿中半衰期分別為8.9 d和8.3 d，氟苯尼考粉比氟苯尼考原藥直接給藥用于日本鰻鱺的半衰期要長，說明藥物作用時間更長；氟苯尼考溶液與氟苯尼考原藥直接給藥用于日本鰻鱺的半衰期相當(dāng)，說明溶液劑型對日本鰻鱺的作用時間沒有因為劑型改變而受到影響。如只以肌肉為食的日本鰻鱺使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液，休藥期所需時間分別為9.9 d和4.5 d；如以整鰻食用的日本鰻鱺使用氟苯尼考粉和氟苯尼考溶液，休藥期就至少需要分別延長至32.1 d和18.2 d。