潮間帶原油污染對泥蚶(Tegillarca granosa)抗氧化酶活性影響與綜合生物標志物響應研究

陳帆，潘玉英,2*，徐青霞，劉銘華，楊金生，楊燦燦，牟成彬，藍青萍

1.浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022

2.浙江省海洋漁業(yè)裝備技術研究重點實驗室，浙江舟山 316022

3.浙江海洋大學石油化工與環(huán)境學院，浙江舟山 316022

近年來，隨著海洋石油勘探開發(fā)項目的不斷涌現(xiàn)，溢油事件時有發(fā)生，必然會影響潮間帶生態(tài)環(huán)境.石油的主要成分是烴類，在200~300種之間，組分復雜[1].海洋溢油擴散形成的油膜會影響海氣交換與光合作用，導致水體缺氧；同時，石油中含有的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)為溢油的主要致毒組分[2]，能夠?qū)е潞Ｑ笊顳NA被破壞甚至中毒死亡[3-4].潮間帶是海洋與陸地交匯的過渡地帶，其生態(tài)體系受到陸地和海洋的共同影響.當潮間帶受到溢油污染后，石油會在潮汐作用下持續(xù)釋放，擴散至沉積物深層或近岸，危害周圍生態(tài)環(huán)境[5].因此，探究潮間帶底棲生物能否作為石油污染評估的哨兵物種，并且尋找合適的生物標志物來反映環(huán)境變化對生態(tài)風險評估具有重要意義.

隨著環(huán)境監(jiān)測技術的不斷進步，國內(nèi)外學者逐漸將目光聚焦于尋找合適的生物標志物指示污染及評估其生物毒性效應.Turja等[6]通過抗氧化防御系統(tǒng)(antioxidant defense system，ADS)等一系列生物標志物，探究油黑殼菜蛤(Mytilustrossulus)等生物暴露于原油中的變化，發(fā)現(xiàn)在2種高暴露濃度(0.120和0.750 mg/L)下，試驗生物PAHs的累積呈在暴露前期增加、后期減少的特征，且不同類型PAHs在生物體的累積率存在顯著差異.蔣鳳華等[7]利用櫛孔扇貝(Chlamys farreri)鰓和消化腺組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性的變化來反映原油水溶性組分(water soluble fraction of crude oil，WSF)的生物毒性，結(jié)果表明，櫛孔扇貝鰓和消化腺組織中SOD和CAT活性在時間-效應上隨暴露時間的增加一般表現(xiàn)為降低?升高?降低的趨勢.Shirani等[8]分析經(jīng)長期石油污染的彈涂魚(Periophthalmuswaltoni)中5種生物標志物的變化，發(fā)現(xiàn)7-乙氧基-3-異吩惡唑酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufin O-deethylase，EROD)、膽汁熒光芳香化合物(fluorescent aromatic compounds，F(xiàn)ACs)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione s-transferase，GST)對PAHs敏感，三者可能成為檢測石油污染的生物標志物.王重剛等[9]研究發(fā)現(xiàn)，梭魚(Mugil so-iuy)暴露于低濃度苯并(a)芘(benzopyrene,BaP)和芘(Pyrene)后，其肝臟中SOD活性表現(xiàn)為被抑制，暴露于高濃度BaP和芘后SOD活性先被抑制后被誘導.林芳等[10]發(fā)現(xiàn)，翡翠貽貝(Pernaviridis)暴露于BaP和滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane,DDT)污染24和48 h后，隨暴露濃度的升高SOD、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性均表現(xiàn)為先被抑制后被誘導.

生物標志物中的抗氧化酶系統(tǒng)對環(huán)境污染響應靈敏，且具備早期預警功能[11-12].SOD、CAT、GST、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)等在協(xié)同、互補、代償、保護等作用下，能夠幫助生物體在污染暴露時清除活性氧自由基(reactive oxygene species，ROS)，從而降低細胞損傷程度，保護機體[13-14].根據(jù)污染物對生物的毒性效應，可選取幾種在特定生物中對污染有顯著響應的生物標志物來檢測污染[15].綜合生物標志物響應(integrated biomarker response，IBR)作為一種更全面可靠的指標，目前已被應用于生物毒性效應評估[16-17]，該指標通過整合量化多個不同生物標志物進行綜合分析，判斷綜合生物毒性響應.

海洋生態(tài)系統(tǒng)復雜且生物種類繁多，少量基礎數(shù)據(jù)樣本不足以滿足污染評估的實際需求，國內(nèi)外開展了許多關于石油烴對海水中魚類、貝類中生物酶活性的研究，但有關潮間帶沉積物原油污染對底棲生物酶活性影響及IBR綜合評價的研究較少，尤其是對潮間帶典型濾食性生物—泥蚶(Tegillarca granosa)的毒性效應研究更為鮮見.因此，該研究以泥蚶作為受試生物，在實驗室條件下模擬受不同濃度原油污染的潮間帶生境，以SOD、CAT、GST和GPx活性為測定指標，探究原油污染下泥蚶鰓和消化腺中抗氧化酶活性的變化，并通過IBR指標評估原油污染對泥蚶的綜合生物毒性效應，以期為潮間帶生物及環(huán)境保護提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗儀器選用紫外可見分光光度計(UV-1100B型，上海美譜達儀器有限公司)、高速離心機12Pro(寧波群安電子科技有限公司)、XH-C旋渦混合器(常州越新儀器制造有限公司)、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)等.試驗試劑以SOD、CAT、GST和GPx試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)及無水乙醇和冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司)等分析純?yōu)橹?

1.2 試驗材料

試驗用泥蚶購自浙江省舟山市老街菜市場.原油取自舟山市岙山島，為流動相輕質(zhì)原油.海水為實驗室自配海水，鹽度為19.00±1.00.沉積物取自舟山市長峙島馬鞍村附近潮間帶，晾干后篩至粒徑小于1 mm備用.室內(nèi)模擬泥蚶實際生存環(huán)境，沉積物本身含有鹽分導致上層海水鹽度最終升至24.50±1.00，介于泥蚶最適生存鹽度20.0~26.2之間[18].

1.3 試驗方法

參照GB 18668?2002《海洋沉積物質(zhì)量》(石油類含量一類、二類和三類標準分別為500、1 000和1 500 mg/kg)，并結(jié)合實際溢油后高濃度污染情況，設置對照組和5個原油濃度處理組，各試驗組原油濃度分別為0、500、1 000、1 500、10 000和15 000 mg/kg，每組設3個平行.基于原油濃度差異，規(guī)定1 500 mg/kg及以下的濃度組為低濃度處理組，高于1 500 mg/kg的濃度組為高濃度處理組.按照不同設置組別，分別選用體積為44 cm×30 cm×26 cm的聚乙烯養(yǎng)殖槽，先加入與原油混合均勻的5 kg沉積物，后加入5 kg實驗室自配海水靜置24 h.選取暫養(yǎng)一周后平均殼質(zhì)量為(10.36±1.13)g的泥蚶，隨機分成18組，每組50只，平均安置于室內(nèi)模擬環(huán)境中.試驗期間連續(xù)充氧，控制溶解氧濃度為(9.40±0.50)μmol/L，水溫為17.50~18.50℃，每隔72 h換水50%.不同處理組及對照組沉積物和上層海水原油濃度的理論值和試驗期間的實測平均值如表1所示，結(jié)果顯示實測環(huán)境原油濃度較理論值普遍偏高.上述結(jié)果可能是由于沉積物本身含有部分石油；除此之外，供試沉積物有機質(zhì)含量較高(委托浙江省海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心測定沉積物中有機質(zhì)含量為6 920 mg/kg)，處理組添加的石油可能會溶解部分有機質(zhì)，導致實測原油濃度偏高.由于沉積物中部分原油會釋放至上層海水，故隨著暴露濃度的升高，上覆水中原油含量增加.

表1 不同試驗組沉積物和上層海水中原油濃度的理論值和實測平均值Table 1 Theoretical and average measured values of oil concentration in sediment and upper seawater at different test groups

試驗中分別于第1、3、6、9、12天采樣，每次隨機選取2只泥蚶.為方便分析，規(guī)定第1、3天為污染前期，第6天為污染中期，第9、12天為污染后期.采樣時仔細分離出鰓與消化腺，用預冷的超純水沖洗并用濾紙吸干水分，稱量并轉(zhuǎn)移至凍存管中用液氮冷凍，?20℃保存.

1.4 樣品預處理

取于冰浴條件下研磨后的鰓與消化腺，按體積比為1∶3添加86%的生理鹽水，制成25%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min.根據(jù)前期預試驗，鰓中SOD、CAT、GST、GPx、蛋白質(zhì)測定所需最佳取樣濃度分別為2.5%、2%、5%、20%、2%，而消化腺中最佳取樣濃度分別為2.5%、2.5%、2.5%、20%、2%.依據(jù)不同組織中各指標最佳取樣濃度，取適量25%組織勻漿離心后的上清液，用生理鹽水稀釋，用于酶活性以及蛋白含量的測定.

1.5 酶活性與蛋白含量測定

抗氧化酶(SOD、CAT、GST和GPx)活性和總蛋白含量測定均嚴格按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行.根據(jù)試劑盒說明并參照文獻[19]，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性(U/mg，以每mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量計)；參照鉬酸銨法測定CAT活性(U/mg，以每mg組織蛋白每s分解1μmol H2O2的量計)；依據(jù)分光光度法測定GST和GPx活性〔U/mg，以每mg組織蛋白每min扣除非酶促反應使反應體系中谷胱甘肽(GSH)濃度降低1μmol/L的量計〕；蛋白含量參考考馬斯亮藍法測定.

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 差異顯著性分析

采用SPSS軟件進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，以單因素(ANOVA)方差分析或非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，其中，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著.通過比較4種酶活性的最大誘導率及最大抑制率〔見式(1)〕，可進一步分析泥蚶鰓和消化腺在不同時間點對不同濃度原油的敏感性.

式中：I為誘導率或抑制率；Ni為試驗組受誘導后的酶活性，U/mg；N0為相應對照組的酶活性，U/mg.I值>0，表現(xiàn)為誘導作用；I值<0，表現(xiàn)為抑制作用.

1.6.2 IBR分析

將SOD、CAT、GST和GPx作為4種目標生物標志物，進行IBR計算.將每種生物標志物數(shù)據(jù)按濃度、時間均一化處理，然后與所有取樣時間點中該標志物均一化數(shù)據(jù)最小值的絕對值相加計算得到各時間點單個生物標志物的得分(Bi值)，并轉(zhuǎn)化為星狀圖中輻射線的長度，最后計算星狀圖三角形面積之和可得IBR值[19].

2 結(jié)果與分析

2.1 原油污染對泥蚶鰓中SOD、CAT、GST、GPx活性變化的影響

受原油污染后，泥蚶鰓4種酶活性變化如圖1所示，在不同原油污染濃度和暴露時間下4種酶活性存在差異.由圖1(a)可見，時間-效應上，隨著污染暴露時間的延長，泥蚶鰓各試驗組的SOD活性均呈升高?降低?升高的變化特征，在污染第3天處理組1的SOD活性達到峰值(210.220 U/mg).劑量-效應上，隨原油濃度的上升，除第1天處理組2和第9天處理組3外，第1、6、9天各試驗組SOD活性總體呈先降低后升高的趨勢；第12天除處理組4外，其余試驗組的SOD活性總體呈先升高后降低的趨勢，與第3天變化趨勢一致.總體上，高濃度處理組泥蚶鰓中的SOD活性在第1、3、9天表現(xiàn)為被抑制，在低濃度處理組SOD活性隨時間能夠逐漸恢復至接近對照組的水平.

圖1 不同濃度原油污染對泥蚶鰓中4種酶活性的影響Fig.1 Effectsof crude oil on four enzyme activities in gills of Tegillarca granosa

由圖1(b)可見，隨處理時間的增加，各試驗組CAT活性總體呈先降低后升高的趨勢.在暴露于原油第6天后，泥蚶鰓的CAT活性降至最低點.隨原油濃度的上升，CAT活性在第1天表現(xiàn)為先被抑制后被誘導的特征，在第6天原油對CAT活性的抑制效果增強.第12天，處理組1鰓中CAT活性升至試驗期峰值(242.08 U/mg)，且此時CAT活性顯著高于對照組(P<0.05).各試驗組CAT活性在第6天均降至最低.

由圖1(c)可見，隨處理時間的增加，各處理組GST活性隨時間總體呈先降低后升高的趨勢，且在第6或第9天達最低值，而對照組GST活性則持續(xù)下降.隨原油濃度的上升，各處理組GST活性在試驗前期(第1、3天)總體呈被抑制趨勢，活性逐漸降低，而試驗后期(第12天)呈先強后弱的被誘導趨勢.第3天，處理組3、4的GST活性均顯著低于對照組(P均小于0.05)，分別為159.63、203.11 U/mg；第12天，處理組2的GST活性為158.89 U/mg，顯著高于對照組(P<0.05).總體而言，第3天是泥蚶鰓GST活性大幅下降的一個時間分界點，且各處理組GST活性在污染前期被抑制，在污染后期被誘導.

由圖1(d)可見，隨處理時間的增加，除處理組3外，其他試驗組泥蚶GPx活性均呈先降低后升高的趨勢，處理組3的GPx活性在第12天出現(xiàn)下降.在受原油污染的第6天，各處理組GPx活性均降至試驗期最低值.隨原油濃度的上升，第3天各處理組GPx活性整體表現(xiàn)為被誘導，第12天則表現(xiàn)為被抑制，其中第3天處理組1的GPx活性(85.29 U/mg)極顯著高于對照組(P<0.01)，處理組4的GPx活性(78.12 U/mg)顯著高于對照組(P<0.05).總體上，隨處理時間的變化各試驗組鰓中GPx活性總體變化規(guī)律較明顯.

2.2 原油污染對泥蚶消化腺中SOD、CAT、GST、GPx活性變化的影響

暴露于原油后，泥蚶消化腺4種酶活性變化如圖2所示.由圖2(a)可見，時間-效應上，隨處理時間的增加，除處理組1外，其余處理組消化腺中SOD活性總體呈先降低后升高的趨勢，且均在第9天出現(xiàn)最低值.劑量-效應上，受低濃度原油污染時泥蚶消化腺中SOD活性被誘導，受高濃度原油污染時被抑制，其中第12天各處理組的SOD活性差異最明顯.第1天處理組3、4和第12天處理組3、5的SOD活性均顯著低于對照組(P均小于0.05)；而第12天處理組1的SOD活性(56.47 U/mg)極顯著低于對照組(P<0.01).受原油污染后，各處理組泥蚶消化腺中SOD活性在試驗前期和后期的變化與對照組差異較大.

圖2 不同濃度原油污染對泥蚶消化腺中4種酶活性的影響Fig.2 Effects of crude oil on four enzyme activities in digestive gland of Tegillarca granosa

由圖2(b)可見，隨處理時間的增加，各試驗組CAT活性總體呈先降低后升高的趨勢.隨原油濃度的上升，第3、6天各處理組泥蚶消化腺中CAT活性較穩(wěn)定，第1、9天呈先被誘導后被抑制的趨勢，而第12天總體被抑制，且第12天處理組1、3、5的CAT活性均顯著低于對照組(P均小于0.05).總體上，在污染后期，泥蚶消化腺中CAT活性開始與對照組出現(xiàn)顯著差異.

由圖2(c)可見，隨處理時間的增加，除2個高濃度處理組GST活性呈“W”型變化特征外，其余各試驗組GST活性總體呈先降低后升高的趨勢，各處理組GST活性均在第3天降至最低值.受低濃度原油污染時，泥蚶消化腺GST活性于第1、9天總體表現(xiàn)為被誘導；受高濃度原油污染時被抑制，而第3、12天總體表現(xiàn)為被抑制.其中，第3天處理組4的原油濃度(10 000 mg/kg)對泥蚶消化腺中GST活性抑制效果最強，其活性(46.14 U/mg)極顯著低于對照組(P<0.01)；另外，第3天處理組1、5的GST活性均顯著低于對照組(P均小于0.5)，分別為145.32、136.73 U/mg.總體上，第3天泥蚶消化腺中GST對原油污染最敏感，具體表現(xiàn)為GST活性與對照組相比被顯著抑制.

由圖2(d)可見，隨處理時間的增加，試驗組GPx活性總體呈升高?降低?升高的趨勢，高濃度處理組的GPx活性均在第9天降至最低值后回升.隨原油濃度的上升，污染前期(第1、3天)各試驗組GPx活性均被不同程度的抑制，而污染后期(第9、12天)則呈低濃度污染時被誘導、高濃度污染時被抑制的特征. 另外，第1天處理組1的GPx活性(19.67 U/mg)顯著低于對照組(P<0.05).總體上，各處理組消化腺中GPx活性在第6天與對照組最接近.

結(jié)合圖1、2發(fā)現(xiàn)，各試驗組鰓和消化腺中4種酶活性隨處理時間的增加均存在不同程度的降低后回升的現(xiàn)象，其中鰓中SOD和消化腺中GPx活性在第3天還出現(xiàn)短暫升高現(xiàn)象.另外，低濃度處理組酶活性回升時間早于高濃度處理組，可能是泥蚶鰓和消化腺對低濃度原油有較好的適應能力或在此環(huán)境中仍有較好的自我調(diào)節(jié)能力.

2.3 鰓和消化腺中4種酶活性的最大誘導率及最大抑制率

原油對泥蚶鰓和消化腺中4種酶活性的最大誘導率、最大抑制率及其對應原油濃度和出現(xiàn)時間如表2所示.由表2可見：除鰓中GPx外，2種組織中4種酶活性的最大誘導率均出現(xiàn)在低濃度處理組的污染后期(第9、12天)；除鰓中GST、GPx以及消化腺中GPx外，2種組織中4種酶活性最大抑制率均出現(xiàn)在高濃度處理組，出現(xiàn)時間均在9天前.此外，原油對鰓中4種酶活性的最大誘導率均大于最大抑制率.與SOD和CAT相比，2種組織中GST和GPx的最大抑制率出現(xiàn)時間更早.

表2 泥蚶鰓和消化腺中4種酶活性的最大誘導率及最大抑制率Table2 Maximum induction rates/inhibition rates of four enzyme activitiesin gills and digestive gland of Tegillarca granosa

2.4 鰓和消化腺中4種酶活性的綜合生物標志物響應(IBR)變化

根據(jù)取樣時間，不同原油濃度脅迫下泥蚶鰓和消化腺中4種抗氧化酶活性均一化處理后得分(Bi)的星狀圖如圖3、4所示.由圖3、4可見：在污染前期(第1、3天)鰓中SOD和GST的Bi值分別激增和驟降，到污染中期(第6天)GPx的Bi值驟降，而在污染后期(第9、12天)CAT和GPx的Bi值較高；消化腺中SOD、CAT和GST的Bi值在污染前期(第1、3天)驟降，在污染中期(第6天)4種酶的Bi值均較低，而在污染后期(第9、12天)SOD和GPx的Bi值均隨原油濃度變化較大.

圖3 泥蚶鰓中4種酶活性的Bi值星狀圖Fig.3 Bi value star plots of four enzyme activitiesin gill of Tegillarca granosa

圖4 泥蚶消化腺中4種酶活性的Bi值星狀圖Fig.4 Bi value star plotsof four enzymeactivities in digestive gland of Tegillarca granosa

通過計算上述星狀圖面積，得到泥蚶鰓和消化腺中4種酶的IBR值.由圖5可見，各試驗組泥蚶2種組織的IBR值均隨處理時間的增加呈先降低后升高的趨勢.鰓和消化腺中4種酶的IBR值分別于第6天、第9天降至最低值后回升，但消化腺中回升幅度遠大于鰓.鰓中4種酶的IBR最高值出現(xiàn)在第1天，而消化腺中出現(xiàn)在第12天.2種組織中各處理組的IBR值均在第6天與對照組最接近，而在污染后期(第9、12天)，與鰓相比，消化腺中高濃度處理組的IBR值與對照組差異更大.

圖5 不同試驗組泥蚶鰓和消化腺中4種酶的IBR值隨時間的變化Fig.5 Changes of IBR values in gills and digestive gland of Tegillarca granosa with time in different experimental groups

3 討論

3.1 原油暴露后泥蚶鰓和消化腺中4種抗氧化酶活性的變化

抗氧化酶活性變化是一個動態(tài)過程，能指示生物氧化脅迫和氧化損傷程度[20].當生物抗氧化和解毒能力下降及污染物脅迫超出防御系統(tǒng)自我修復能力時，可能出現(xiàn)中毒反應[21].石油烴進入水生生物體后，可通過自身或中間代謝產(chǎn)物的氧化還原反應產(chǎn)生大量活性氧自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基、H2O2等，使機體無法維持低水平、穩(wěn)定平衡的生理性自由基含量而造成機體細胞非特異性氧化損傷[22].

SOD作為抵抗ROS的第一道防線，是以氧自由基連鎖反應前體物超氧陰離子自由基為唯一底物的天然酶類清除劑，當受到外界污染脅迫時，其活性變化較其他幾種抗氧化酶更靈敏[19].筆者研究發(fā)現(xiàn)，消化腺中SOD平均活性(132.29 U/mg)約為鰓(69.34 U/mg)的2倍.尚泰宇等[23]在生物脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，在高濃度氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)污染環(huán)境下，生物體內(nèi)SOD活性隨污染物濃度的升高呈先被誘導后被抑制的趨勢，與筆者試驗中SOD活性的劑量-效應結(jié)果基本相符.針對處理組5中SOD活性基本都小于對照組的現(xiàn)象，可能是高濃度(15 000 mg/kg)原油對泥蚶鰓和消化腺造成了一定的不可逆損傷，故處理組SOD活性無法回升至對照組水平[9-10].

CAT能催化H2O2生成水和氧氣，避免過多的ROS堆積，從而保護機體[24-25].在解毒作用上，SOD與CAT具有協(xié)同作用，但活性變化存在時間差.隨著污染物濃度的增加，鰓和消化腺中CAT與SOD的活性變化趨勢相同或部分相同[26].在原油暴露第1天，鰓中CAT活性隨原油濃度的升高先被抑制后被誘導，與黃海膽(Glyptocidariscrenularis)在低濃度180號燃料油污染暴露試驗中CAT活性被抑制[27]的結(jié)果相同.參照最大誘導率及最大抑制率的結(jié)果(見表2)，在高濃度原油污染暴露下，泥蚶CAT總體比SOD更敏感，因此與SOD相比，CAT更適合作為高濃度石油污染監(jiān)測的生物標志物.

GST是一種具有多種生理功能的同工酶，是生物體內(nèi)重要的解毒酶，發(fā)揮解毒與清除體內(nèi)活性氧自由基的雙重功能[8,28].在時間-效應上，鰓中GST活性總體表現(xiàn)為先被抑制后被誘導；劑量-效應上，處理組GST活性在試驗后期(第9、12天)總體呈先升高后降低的特征，此規(guī)律與已有研究結(jié)果[29]相符.對比最大誘導率和最大抑制率發(fā)現(xiàn)，在高濃度原油暴露環(huán)境(處理組4)中，消化腺中GST活性能在短時間內(nèi)(第3天)被顯著抑制.結(jié)合筆者研究及已有研究成果[30-31]，GST有望成為短期高濃度石油污染監(jiān)測的高效生物標志物.

GPx利用GSH作為底物，能與抗氧化防御系統(tǒng)中的SOD和CAT一起將超氧陰離子自由基和H2O2還原為H2O，從而保護生物體[19,32].時間-效應上，泥蚶鰓中GPx活性總體表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，消化腺中則相反.劑量-效應上，消化腺中GPx活性在原油污染前期被抑制；在后期，低濃度原油污染時被誘導，在高濃度原油污染時被抑制，與大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)原油污染暴露試驗結(jié)果[33]相同.筆者研究顯示，泥蚶鰓和消化腺中GPx活性的最大抑制率在原油濃度較低、污染時間較短時出現(xiàn)，表明泥蚶鰓和消化腺中GPx活性都能在短時間內(nèi)對外界污染脅迫作出反應.比較泥蚶鰓和消化腺中GPx對原油污染脅迫時的活性變化發(fā)現(xiàn)，鰓中GPx對原油更敏感，表明受原油污染脅迫時鰓中GPx活性的激發(fā)程度更高或鰓是GPx發(fā)揮作用的主要器官.

在抗氧化酶發(fā)揮其防御作用時，SOD最先參與反應，而其中間產(chǎn)物H2O2可作為CAT的催化底物，也能作為GPx的部分底物.上述3種酶與作為Ⅱ相解毒酶的GST形成一個整體，最終對生物起到保護作用.結(jié)合時間-效應與劑量-效應，受原油污染后，泥蚶鰓中SOD與CAT活性能較快恢復至對照組水平，而GST與GPx活性均能在污染前期做出較強烈的反應；消化腺中CAT活性變化晚于SOD，而GST活性較GPx更早表現(xiàn)出受原油污染的特征.綜上，生物作為有機整體，其抗氧化酶活性的變化是一個連鎖反應，各種酶對于清除ROS具有協(xié)同作用.

3.2 原油暴露對泥蚶毒性效應的IBR評價

將各生物標志物的標準化結(jié)果以星狀圖的形式呈現(xiàn)，有助于深入挖掘綜合生物毒性效應[34].通過觀察星狀圖面積的變化，可更直觀地展現(xiàn)出泥蚶受原油污染脅迫的時間-效應與劑量-效應.筆者研究發(fā)現(xiàn)，鰓中4種酶IBR最低值出現(xiàn)的時間早于消化腺；在污染后期，與鰓相比，泥蚶消化腺中4種酶的IBR值與對照組差異更大.總體而言，鰓和消化腺中4種酶的IBR值變化與4種酶的活性變化趨勢基本吻合，表明IBR可作為評估原油污染對潮間帶生物綜合生物毒性效應的有效指標[35].

4 結(jié)論

a)泥蚶受原油污染后，鰓和消化腺中SOD、CAT、GST和GPx的活性均表現(xiàn)出不同程度的被誘導或被抑制的效應，通過比較2種組織的抗氧化酶活性大小、最大誘導率及最大抑制率對應的濃度和出現(xiàn)時間發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶活性變化是一個受多種因素影響制約的動態(tài)過程.

b)根據(jù)生物體代謝機制，4種酶存在相互作用.SOD和CAT協(xié)同解毒作用在鰓和消化腺中均有體現(xiàn)，SOD活性總體表現(xiàn)為受低濃度原油污染時被誘導，受高濃度原油污染時被抑制的特征.CAT活性在時間-效應上與SOD活性變化規(guī)律相似，但其響應時間具有滯后性，GST與GPx活性的時間-效應總體相似.

c)從原油污染對4種抗氧化酶活性影響的角度分析，泥蚶消化腺中酶活性的變化較腮中更具規(guī)律性和顯著性.GST和GPx作用機理相似，且對高濃度原油污染的生物響應更高效和顯著.因此，對比其他抗氧化酶與組織，該研究中泥蚶消化腺中GST更適于作為短期高濃度石油污染監(jiān)測的有效生物標志物.

d)通過計算IBR進一步發(fā)現(xiàn)，泥蚶鰓和消化腺的IBR值均隨暴露時間的增加呈先降低后升高的趨勢.星狀圖和IBR值能更直觀且全面深入地探討綜合生物毒性效應，因此IBR可作為綜合生物毒性評價的指標.