微重力環(huán)境下肢體廢用性萎縮對(duì)于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分和表型分化的作用研究

曲彥隆 劉思遙 南 飛 劉祿萌 閆 謹(jǐn)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,黑龍江 哈爾濱 150001)

隨著航天事業(yè)的發(fā)展,越來越多的航天員進(jìn)入太空。在復(fù)雜的航天環(huán)境中,人體始終處于微重力狀態(tài),返回地球后往往出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙等并發(fā)癥[1-2]。因此,長時(shí)間太空航行后,航天員必須在專業(yè)醫(yī)護(hù)人員的攙扶下離開返回艙,并且康復(fù)過程漫長。目前在微重力環(huán)境下,關(guān)節(jié)軟骨損傷作為膝關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙的重要原因,少有報(bào)道。膝關(guān)節(jié)軟骨作為承重軟骨,對(duì)于生物力學(xué)負(fù)載的變化非常敏感[3]。在太空微重力環(huán)境中,航天員的作業(yè)多通過上肢來完成,下肢長期處于去負(fù)載的狀態(tài)。而軟骨組織其中缺乏血管、淋巴與神經(jīng)組織,一旦損傷就難以修復(fù),逐步發(fā)展為不可逆的損傷。還會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定,代償性結(jié)締組織改變等問題,最終導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)的疼痛和活動(dòng)受限。隨著軟骨細(xì)胞的受損,一些碎屑及化學(xué)物質(zhì)會(huì)被釋放,從而導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)疼痛逐漸加重[4],上述變化的最終結(jié)果就是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)[5],對(duì)航天員的關(guān)節(jié)健康造成不可挽回的嚴(yán)重后果。因此我們認(rèn)為,如何預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨損傷比治療更重要。通過研究軟骨組織在微重力環(huán)境下受到的去負(fù)載損傷,減輕航天員回歸后的膝關(guān)節(jié)疼痛與活動(dòng)障礙,加速航天員的康復(fù),避免KOA的發(fā)展。本研究對(duì)微重力環(huán)境下的軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)MMP-13及II型膠原等成分進(jìn)行了對(duì)比和分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:4周齡SD大鼠30只,雌雄不限,60-75g。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器:分析天平(Mettler toledo公司,中國),Odyssey紅外光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR公司,美國),倒置顯微鏡(Leica公司,德國),恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder公司,德國),低溫離心機(jī)、高速離心機(jī)(Beckman coulter公司,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM-F12培養(yǎng)基(大連美侖生物技術(shù)有限公司),0.25%胰蛋白、Ⅱ型膠原酶(GIBCO公司,美國),Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司),青-鏈霉素雙抗(Hy-Clone公司,美國)。

2 實(shí)驗(yàn)方法:軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定。

2.1 軟骨細(xì)胞分離:選取實(shí)驗(yàn)大鼠,無菌條件下分離軟骨組織,將軟骨切成1mm3大小的組織塊。PBS沖洗后加入II型膠原酶,置于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)、消化、過濾、離心,在培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞,隨后接種于培養(yǎng)皿中,37℃恒溫,5%CO2濃度,飽和濕度,進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng):吸去培養(yǎng)基后PBS漂洗干凈,加入胰蛋白酶進(jìn)行消化,離心。加入DMEN培養(yǎng)基,將均勻懸液中的細(xì)胞接種于2個(gè)培養(yǎng)皿中,按照上述條件繼續(xù)培養(yǎng),傳代。第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 微重力環(huán)境下軟骨細(xì)胞生長檢測:取P3代大鼠軟骨細(xì)胞,正常重力軟骨細(xì)胞組、正常重力關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組、微重力軟骨細(xì)胞組、微重力關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組。利用雙向多樣本細(xì)胞微重力培養(yǎng)裝置,于轉(zhuǎn)速30rpm/min、溫度37℃,培養(yǎng)72小時(shí),提供微重力環(huán)境。關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞則采用10ng/ml IL-1β誘導(dǎo)48小時(shí)造模,倒置相差顯微鏡下觀察各組軟骨細(xì)胞,記錄生長情況與形態(tài)變化。

2.4 Western blot檢測:2組取部分軟骨組織。加入RIPA裂解液,4℃條件下裂解1小時(shí)。裂解完成后,將各樣本上機(jī)酶標(biāo)儀測量蛋白濃度。根據(jù)BCA蛋白測定的結(jié)果,向齒槽中加入適量的蛋白,觀察溴酚藍(lán)的移動(dòng)情況。將制備完成的PVDF膜在搖床上封閉1-2小時(shí),并加入一抗,4℃環(huán)境下?lián)u床上孵育12小時(shí)。吸取一抗,靜置1小時(shí),隨后用TBST洗滌3×10分鐘。加入二抗,4℃環(huán)境下?lián)u床上孵育2小時(shí)。在暗室中取出孵育后的PVDF膜,洗滌后置于成像分析儀中進(jìn)行成像,軟骨細(xì)胞表型相關(guān)蛋白MMP13、II型膠原的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,若數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,以中位數(shù)(4分位數(shù))表示;計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分比(n,%)表示。組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,3組以上兩兩比較采用t檢驗(yàn),多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方(x2)檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān),非正態(tài)分布采用Spearman相關(guān)。P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 鏡下觀察軟骨細(xì)胞,可見軟骨細(xì)胞集落樣生長,多層重疊,基質(zhì)分泌充足(見圖1A、圖1B),可見典型鋪路石樣改變。與哈爾濱工業(yè)大學(xué)合作,利用雙向多樣本細(xì)胞微重力培養(yǎng)裝置,于微重力環(huán)境下行軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng),鏡下觀察,相對(duì)于地面組可見軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂,界限模糊,典型鋪路石樣表現(xiàn)缺如(見圖1C、圖1D)。

圖1 微重力下軟骨細(xì)胞失去典型鋪路石樣改變。(40×)(A)地面骨關(guān)節(jié)炎組;(B)地面正常軟骨組;(C)微重力骨關(guān)節(jié)炎組;(D)微重力正常軟骨組。

4.2 微重力環(huán)境下可促進(jìn)正常軟骨和關(guān)節(jié)炎軟骨中的MMP-13與II型膠原的表達(dá)。MMP-13及II型膠原的測定在地面組和微重力組相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果如下(見圖2)。結(jié)果顯示,無論是正常軟骨還是關(guān)節(jié)炎軟骨,MMP-13及COL-II的相對(duì)蛋白水平均為微重力組明顯高于正常地面組,說明微重力下軟骨細(xì)胞的ECM合成與分解活動(dòng)增強(qiáng)(P〈0.05)。

圖2 Western blot法測定地面及微重力環(huán)境下正常軟骨和關(guān)節(jié)炎軟骨中的MMP-13、II型膠原的表達(dá)。無論是正常軟骨還是關(guān)節(jié)炎軟骨,MMP-13及II型膠原的相對(duì)蛋白水平均為微重力組明顯高于正常地面組。

討 論

微重力環(huán)境改變了正常膝關(guān)節(jié)面之間的應(yīng)力分布。根據(jù)Fitzgerald J等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠軟骨組織厚度在30天的太空航行后減少將近1/3[6]。而長時(shí)間的去負(fù)載狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致軟骨組織膠原降解、蛋白聚糖含量明顯減少[7]。不同頻率、不同張力的機(jī)械負(fù)荷對(duì)軟骨細(xì)胞增殖分化的影響不同。過強(qiáng)或者過弱的機(jī)械負(fù)荷會(huì)上調(diào)炎性因子表達(dá),導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分解增加、合成水平下降,軟骨細(xì)胞的表型被破壞,甚至出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)征象。而適宜的機(jī)械負(fù)荷能夠通過給予軟骨細(xì)胞機(jī)械刺激促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[8],促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成,對(duì)軟骨細(xì)胞表型維持有著積極的影響[9-10]。本實(shí)驗(yàn)論證了微重力環(huán)境下培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞形態(tài)較不規(guī)則,排列紊亂,界限模糊,失去了典型的“鋪路石樣”表現(xiàn)。且Western blot結(jié)果顯示,能夠分解關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分的關(guān)鍵因素MMP-13的表達(dá)也因微重力環(huán)境而上調(diào)。這與上述研究結(jié)果較為一致。針對(duì)于本實(shí)驗(yàn)微重力環(huán)境下有助于軟骨細(xì)胞的增殖培養(yǎng)、表型維持則更多的可能是微重力環(huán)境下懸浮培養(yǎng)模式和正常軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)模式的不同所導(dǎo)致的結(jié)果。我們后續(xù)希望通過在體實(shí)驗(yàn)構(gòu)建大鼠的肢體廢用性萎縮去負(fù)載模型,更加完備的模擬微重力環(huán)境對(duì)于膝關(guān)節(jié)內(nèi)部靜水壓和應(yīng)力分布的影響,從而更加深入細(xì)致的探究微重力下肢體廢用性萎縮導(dǎo)致軟骨損傷的具體機(jī)制。