激光誘導(dǎo)空泡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

周啟光, 程 靜, 鄭璐璐, 張大偉

(上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院, 上海 200093)

引 言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人民素質(zhì)的普遍提高,身處和諧社會(huì)的人們對(duì)自身健康的重視程度也越來(lái)越高。因此,研究人員對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究也越來(lái)越深入,生物醫(yī)學(xué)在所有學(xué)科中的地位也越來(lái)越重要。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,主要研究對(duì)象就是細(xì)胞,但細(xì)胞的尺寸只有微米級(jí),對(duì)單一細(xì)胞的操作工具比較少,因此,研究人員想到利用激光誘導(dǎo)空泡產(chǎn)生的沖擊波來(lái)作為對(duì)單一細(xì)胞操作的“工具”。激光誘導(dǎo)空泡的方法的優(yōu)點(diǎn)是:(1) 精度高,激光誘導(dǎo)空泡的尺寸在微米級(jí),與細(xì)胞尺寸相當(dāng);(2) 非侵入式,可以用于密閉且透明的微流腔內(nèi),甚至是活體組織表面及淺層。

近年來(lái),隨著微流控這一新興研究領(lǐng)域的逐漸升溫,激光脈沖誘發(fā)氣泡空化作為一種新的微流體驅(qū)動(dòng)機(jī)制應(yīng)運(yùn)而生。它在高阻尼的環(huán)境中為高速微流體驅(qū)動(dòng)提供高能量密度,高能量轉(zhuǎn)換,高度局部化和大的機(jī)械力。能量通過(guò)自由空間光學(xué)傳播傳遞,不需要任何物理電氣或機(jī)械互連,這大大降低了器件制造的復(fù)雜性。它還融合了圖像處理等領(lǐng)域,具有集成光學(xué)掃描儀和透鏡的并行驅(qū)動(dòng)的潛力。

高功率激光束(功率密度約108W/cm2以上)在液體介質(zhì)中有一個(gè)脈沖周期左右的能量沉積后,則液態(tài)物質(zhì)的特性、狀態(tài)發(fā)生變化,例如:宏觀上激光與液態(tài)物質(zhì)相互作用區(qū)域發(fā)生溫升、介質(zhì)膨脹、汽化、空泡形成等物理現(xiàn)象;微觀上電子空穴出現(xiàn)激發(fā)躍遷、分子離解和原子電離等物理現(xiàn)象。激光擊穿液體介質(zhì)的一個(gè)重要現(xiàn)象是沖擊波輻射,其生成的原因是,當(dāng)激光功率密度超過(guò)液體的擊穿閾值后,在聚焦區(qū)域形成高溫高壓的等離子體,該等離子體吸收后續(xù)激光能量對(duì)外膨脹,就會(huì)壓縮周?chē)后w。在等離子體前方產(chǎn)生一系列壓縮波的疊加,從而產(chǎn)生間斷面很陡的沖擊波波陣面。

1 激光誘導(dǎo)空泡現(xiàn)象用于細(xì)胞穿孔

將外源分子遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是基因轉(zhuǎn)染和一些特定類型疾病治療處理的基礎(chǔ)。此外,靶向特定單細(xì)胞分子遞送的能力在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多研究中是很重要的,例如干細(xì)胞研究[1],單細(xì)胞分析[2]和其他需要在原位誘導(dǎo)單細(xì)胞修飾的研究性實(shí)驗(yàn)。廣泛使用的分子遞送方法有基于病毒或化學(xué)的轉(zhuǎn)染[3-4]和使用脈沖電場(chǎng)的電穿孔,這些技術(shù)在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔,并且這些孔適用于將分子轉(zhuǎn)移到大群細(xì)胞中[5-6]。

飛秒激光也已用于細(xì)胞穿孔,例如,使用飛秒激光穿孔的轉(zhuǎn)染效率對(duì)于干細(xì)胞系可以達(dá)到80%[7],而對(duì)于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞可以達(dá)到90%[8],還可以實(shí)現(xiàn)在穿孔中的高空間精度,分辨率小于單個(gè)細(xì)胞的尺寸。飛秒激光需要精確地聚焦在上部細(xì)胞膜表面上[9],在焦平面中的3 μm的偏差(這可能是由于單元高度的變化引起)可導(dǎo)致大于50%的蝕刻效率的降低。

美國(guó)夏威夷大學(xué)的研究人員將激光誘導(dǎo)空化現(xiàn)象應(yīng)用到微流控上,利用氣泡產(chǎn)生的沖擊波的剪切力使細(xì)胞膜切開(kāi)一個(gè)小口(尺寸在30 nm),從而使藥物通入到細(xì)胞內(nèi)。他們所使用的激光器是最大功率為800 mW(Laserlands,980MD-0.8W-BL)的980 nm二極管激光器;微流控芯片的結(jié)構(gòu)是吸光基底,由涂覆有厚度為200 nm的銦錫氧化物(ITO)層的1 mm厚的載玻片組成,頂部覆蓋有1 μm厚的非晶硅(α-silicon)層,來(lái)自激光器的大部分入射光(70%)在吸收性基材的ITO和α-硅層中被吸收并轉(zhuǎn)化成熱,在基材上產(chǎn)生蒸氣微泡。如圖1所示:通過(guò)基底的光學(xué)加熱在靶細(xì)胞附近產(chǎn)生微米級(jí)氣泡(圖1(a));氣泡迅速膨脹,引起圍繞氣泡的微流動(dòng)和相應(yīng)的剪切應(yīng)力,剪切應(yīng)力可以通過(guò)由微泡表面上的溫度梯度產(chǎn)生的熱毛細(xì)作用力而增大(圖1(b));細(xì)胞上的剪切應(yīng)力還可以在膜中產(chǎn)生納米級(jí)孔,增強(qiáng)膜的通透性,并且對(duì)細(xì)胞的不利影響很小,氣泡的大小在不停地振蕩,細(xì)胞膜變得對(duì)分子是可滲透的(圖1(c));當(dāng)激光消失后,穿孔也立即停止并且細(xì)胞膜快速?gòu)?fù)原(圖1(d))。由于激光誘導(dǎo)產(chǎn)生的氣泡存在的時(shí)間在幾十微秒到幾百微秒量級(jí),所以細(xì)胞膜受到氣泡沖擊波的作用時(shí)間短,細(xì)胞的活力不會(huì)受到氣泡產(chǎn)生的沖擊波的影響。從他們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看到,氣泡最佳的位置是離細(xì)胞5 μm范圍內(nèi),穿孔效率可以達(dá)到95%,且細(xì)胞活性達(dá)到97%[10]。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)是:(1) 將激光擊穿液體形成空泡現(xiàn)象與微腔室結(jié)合,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿孔操作;(2) 利用激光擊穿液體空泡的剪切力,使細(xì)胞壁破裂,從而進(jìn)行物質(zhì)交換;(3) 使用微秒激光器,作用時(shí)間短,從而細(xì)胞膜還可以恢復(fù),使細(xì)胞保持活性。

圖1 激光誘導(dǎo)細(xì)胞穿孔的原理圖Fig.1 Laser induced cell perforation

2 激光誘導(dǎo)空泡現(xiàn)象用于細(xì)胞檢測(cè)

紅細(xì)胞的彈性特性可作為幾種疾病的檢測(cè)指標(biāo)[11-12],例如,惡性瘧原蟲(chóng)加強(qiáng)感染的紅細(xì)胞,即感染的細(xì)胞具有更高的彈性模量,并且在比未感染的細(xì)胞更短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)它們的形狀。紅細(xì)胞彈性的變化也是身體識(shí)別需要從流通中除去的老化紅細(xì)胞的一種自然方式[13],研究人員已經(jīng)證明了幾種衡量紅細(xì)胞機(jī)械性能的方法,其中有微量吸管[14]、扭轉(zhuǎn)微磁珠[15]、原子力顯微鏡[16]、剪切流[17]、光學(xué)鑷子[18-19]和光學(xué)擔(dān)架[20]等方法。

新加坡南洋理工大學(xué)研究人員將激光誘導(dǎo)空化現(xiàn)象應(yīng)用到微腔內(nèi),利用氣泡沖擊波的沖擊力對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)力形變,再通過(guò)觀測(cè)細(xì)胞恢復(fù)所需的時(shí)間,從而算出不同紅細(xì)胞的細(xì)胞膜硬度,如圖2所示,進(jìn)而通過(guò)這種方法對(duì)紅細(xì)胞的細(xì)胞膜硬度進(jìn)行測(cè)定,來(lái)判斷紅細(xì)胞是否受到病毒感染[21]。他們所使用的激光器是倍頻Nd:YAG激光器,在532 nm處產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間為6 ns的單個(gè)激光脈沖,微流控芯片結(jié)構(gòu)由兩個(gè)顯微鏡蓋滑塊(尺寸22 mm×40 mm)制成,并用15 μm高的扁平鋁箔間隔隔開(kāi)?？傊?新方法的優(yōu)點(diǎn)是,只需要利用一束脈沖激光就可同時(shí)探測(cè)多個(gè)單元且周轉(zhuǎn)時(shí)間少于1 s。技術(shù)的處理被大大簡(jiǎn)化,因?yàn)闆](méi)有外部探針需要連接到細(xì)胞(如對(duì)于光學(xué)鑷子和磁性微珠技術(shù)),或者單個(gè)細(xì)胞需要精確地與交叉的一對(duì)光纖對(duì)準(zhǔn)(如光學(xué)擔(dān)架的技術(shù))。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比,這種簡(jiǎn)化允許在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

圖2 紅細(xì)胞氣蝕實(shí)驗(yàn)Fig.2 The experiment of red blood cells during the cavitation event

此外,該方法中的所有步驟(例如,探測(cè)、圖像采集和分析以及樣品分類)都可以集成到實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化的芯片平臺(tái)中,用于測(cè)試大量細(xì)胞群體的機(jī)械性能。將來(lái),這種方法還可以應(yīng)用于研究溶液中其他種類的細(xì)胞,例如探測(cè)良性和惡性白細(xì)胞之間機(jī)械性能的差異。

3 激光誘導(dǎo)空泡現(xiàn)象與微流控的結(jié)合用于細(xì)胞篩選

將微型流體裝置用于生物細(xì)胞操作,再搭配微型計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的系統(tǒng)具有很大的應(yīng)用前景。因?yàn)檫@種計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)化微型流體裝置可以降低試劑成本和反應(yīng)時(shí)間,改進(jìn)了小型化系統(tǒng)中質(zhì)量和傳熱控制[22-26]。微流體的機(jī)制包括:通過(guò)膜閥實(shí)現(xiàn)的氣動(dòng)泵送[27],通過(guò)電動(dòng)力學(xué)機(jī)制的電滲[28]、介電泳[29]以及光學(xué)力[30]、光熱[31]和壓電致動(dòng)器[32]等。

加州大學(xué)洛杉磯分校研究人員利用高度聚焦的激光束可以在幾納秒內(nèi)以高達(dá)100 m/s的快速膨脹速度和幾十MPa的內(nèi)部壓力引發(fā)蒸汽氣泡,并且這種快速響應(yīng)和較強(qiáng)的沖擊力所引起的激光觸發(fā)空化氣泡可以強(qiáng)烈擾亂通道附近流動(dòng)的流體。他們采用脈沖持續(xù)時(shí)間為15 ns的Nd:YAG激光器,其倍頻波長(zhǎng)為532 nm,能量為108 μJ,聚焦在50 μm寬的微流體通道的中間。該團(tuán)隊(duì)利用這個(gè)現(xiàn)象做了3種新穎的應(yīng)用,分別是高速微流體開(kāi)關(guān),超高速微液滴生成裝置和熒光細(xì)胞篩選器[33],其中:高速微流體開(kāi)關(guān)可以在2 μs內(nèi)變形20 μm的距離,這是到目前為止,已經(jīng)證實(shí)的最快的微流體驅(qū)動(dòng);超高速微液滴生成裝置,能夠根據(jù)需要產(chǎn)生均勻的油浸水滴,尺寸范圍為1～150 pL,速度每秒能達(dá)到1萬(wàn)滴;熒光細(xì)胞篩選器是利用了脈沖激光觸發(fā)熒光激活微流體開(kāi)關(guān)的原理。

圖3為熒光細(xì)胞篩選器的實(shí)驗(yàn)原理圖,該設(shè)備由具有兩個(gè)出口的收集和廢棄物的主微通道(或樣品通道)組成,使用慣性流體動(dòng)力學(xué)聚焦,待篩選的細(xì)胞流向廢棄物通道。當(dāng)熒光細(xì)胞流過(guò)Y結(jié)的頂部時(shí)被檢測(cè),同時(shí)將通過(guò)高數(shù)值孔徑的物鏡聚焦的激光脈沖觸發(fā)到與主通道平行運(yùn)行的脈沖通道,聚焦的激光脈沖引起隨后的氣蝕氣泡。當(dāng)氣泡膨脹時(shí),周?chē)囊后w被推開(kāi)并通過(guò)噴嘴開(kāi)口擠入主通道,并將熒光細(xì)胞擠進(jìn)收集通道中。這個(gè)實(shí)驗(yàn)還可以通過(guò)優(yōu)化微流腔的體積和待測(cè)細(xì)胞液的濃度等參數(shù)來(lái)分析篩選的效率。

圖3 熒光細(xì)胞篩選器的實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.3 The schematic diagram of fluorescence cell filter experimental

4 激光誘導(dǎo)空泡現(xiàn)象用于眼科手術(shù)

由于激光能量很高,超短激光脈沖的緊密聚焦導(dǎo)致聚焦處發(fā)生非線性吸收過(guò)程[34-36],利用光破壞的基本物理作用將其應(yīng)用于生物組織的剝離。因此,眼科手術(shù)一般用飛秒激光器,由于激光作用在眼球的時(shí)間短,對(duì)組織其他部分影響小。將單個(gè)超短激光脈沖聚焦到透明生物組織的水性介質(zhì)后的基本相互作用原理已被廣泛研究[37-40]。

德國(guó)漢諾威生物醫(yī)學(xué)光學(xué)系的Nadine Tinne博士等,用飛秒激光器發(fā)射出兩個(gè)不同時(shí)間間隔和聚焦位置的脈沖激光,研究這兩個(gè)激光誘導(dǎo)氣泡的相互作用影響[41]。他們用中心波長(zhǎng)1 040 nm、脈沖寬度389 fs、重復(fù)頻率100 kHz的IMRA America Inc.(Ann Abor,USA)的飛秒激光系統(tǒng),通過(guò)掃描高重復(fù)率飛秒激光器的組織切割實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這可能會(huì)導(dǎo)致空化氣泡和后續(xù)激光脈沖在聚焦處發(fā)生空間和時(shí)間上的重疊,兩個(gè)氣泡的重疊會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)噴射流(如圖4所示),這會(huì)對(duì)其他組織造成影響。這項(xiàng)研究表明,為了提高光致破壞效率或軸向精度并減少不必要的副作用,必須避免高重疊,才可以確保微創(chuàng)手術(shù)的準(zhǔn)確性。在眼科手術(shù)中,激光能量應(yīng)該接近略高于擊穿閾值來(lái)解剖組織?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)都是在豬的眼球玻璃體上進(jìn)行,實(shí)際人眼的情況會(huì)更加復(fù)雜。

圖4 兩個(gè)腔相互作用的氣泡動(dòng)力學(xué)形成射流(71.8 μm的焦距分離和激光脈沖能量是擊穿閾值的10.7倍)Fig.4 Bubble-kinetic jet formation with two cavities interacting(the focal length separation for 71.8 μm and the laser pulse energy is 10.7 times the breakdown threshold)

此類實(shí)驗(yàn)對(duì)激光的焦點(diǎn)要求很高,誤差不能超過(guò)1 μm,因此,可以考慮使用自帶會(huì)聚鏡頭的光纖激光器來(lái)侵入到樣品,這樣可以排除樣品內(nèi)部自聚焦等影響,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有更高的可信度。

5 總結(jié)與展望

本文介紹了激光誘導(dǎo)空泡的神奇現(xiàn)象,正所謂量變產(chǎn)生質(zhì)變,即當(dāng)單脈沖激光的能量密度達(dá)到某介質(zhì)的擊穿閾值[42-45]的時(shí)候,就會(huì)產(chǎn)生一些非線性效應(yīng),如多光子電離機(jī)制[46-49]和雪崩電離機(jī)制,進(jìn)而產(chǎn)生等離子體[50],并伴隨等離子體閃光現(xiàn)象。等離子體通過(guò)逆韌致機(jī)制和共振機(jī)制繼續(xù)吸收激光能量[51],進(jìn)而產(chǎn)生空化氣泡現(xiàn)象,并伴隨沖擊波的形成[52-55]。沖擊波的產(chǎn)生是激光切割的副產(chǎn)品,沖擊波將會(huì)對(duì)待切割組織的其他部位產(chǎn)生不利的影響,還會(huì)有射流的形成。未來(lái)在激光微創(chuàng)手術(shù)的研究中,應(yīng)考慮如何避免伴隨激光誘導(dǎo)氣泡形成的沖擊波,或者考慮如何降低沖擊波帶來(lái)的不利影響。生物組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜,既有似水流體,又有組織結(jié)構(gòu)固體,因此,激光導(dǎo)入生物組織內(nèi)部會(huì)有一些自聚焦和散射的不利于激光傳播的影響。這方面可以考慮借鑒光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)(optical coherence tomography,OCT)的做法,預(yù)埋一根光纖就可以將激光安全地導(dǎo)入生物組織內(nèi)部。還有在等離子體運(yùn)動(dòng)的控制上,可以考慮加上一定的磁場(chǎng)來(lái)控制等離子體的運(yùn)動(dòng),從而降低對(duì)組織其他部位的不利影響。這種非侵入式的醫(yī)學(xué)治療手段,可以大大緩解病人的傷痛,降低手術(shù)帶來(lái)的副作用,使病人更容易接受。非侵入式醫(yī)療技術(shù)在未來(lái)的臨床手術(shù)中的地位將越來(lái)越高,成為主流醫(yī)療技術(shù)。

在微流控領(lǐng)域,我們可以利用激光誘導(dǎo)氣泡產(chǎn)生的局部巨大能量來(lái)做成一些微小器件,從而對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行有效的操作,例如,檢測(cè)單細(xì)胞的健康情況、篩選單細(xì)胞以及分子注入單細(xì)胞等操作。我們可以看到,激光誘導(dǎo)空泡現(xiàn)象對(duì)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展已經(jīng)提供了不少幫助,產(chǎn)生了一些積極影響,未來(lái)還會(huì)跟計(jì)算機(jī)領(lǐng)域有所合作,從而代替實(shí)驗(yàn)員的手來(lái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作,使一些需要細(xì)微操作的實(shí)驗(yàn)更容易實(shí)現(xiàn),并且使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度大大提高。