通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植對(duì)血管性認(rèn)知障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腸道菌群的影響

劉懷峻,顏習(xí)武,張秋池,孟 婷,劉金鳳,常 誠(chéng)

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210046；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029)

血管性認(rèn)知障礙是腦血管病變導(dǎo)致的卒中或亞臨床腦血管病引起的記憶、認(rèn)知、行為等腦區(qū)低灌注綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前各國(guó)指南無一致推薦治療藥物[1-2]。通腦益智顆粒是江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有通瘀開竅、化痰和絡(luò)、補(bǔ)益脾腎的功效，臨床用于治療血管性認(rèn)知障礙患者取得較好的臨床療效[3]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。近年來研究認(rèn)為，腸道菌群紊亂與認(rèn)知障礙等多種急慢性疾病密切相關(guān)[4-5]，且腸道菌群與中醫(yī)藥治療存在相互影響的關(guān)系，兩者在正常生理?xiàng)l件下互相配合發(fā)揮作用，而病理狀態(tài)下的腸道菌群會(huì)減弱中藥的療效[6-8]。隨著“腦腸軸”理論的完善[9]，菌群移植近年來成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法，為直接改變腸道菌群進(jìn)而治療疾病提供了新思路[10-11]。本實(shí)驗(yàn)通過建立血管性認(rèn)知障礙大鼠模型，探討了通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植技術(shù)治療血管性認(rèn)知障礙的可能機(jī)制，以為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，8周齡左右，體重250～350 g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境保持溫度和相對(duì)濕度分別在20～25 ℃和40%～60%，12 h光照/黑暗循環(huán)，適應(yīng)環(huán)境并自由飲食1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(2020DW-08-02)。

1.2藥物 通腦益智顆粒：方由制大黃6 g、廣郁金10 g、炙黃芪10 g、川芎6 g、石菖蒲12 g、枸杞10 g、水蛭3 g、益智仁10 g、仙鶴草15 g組成，經(jīng)由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部批準(zhǔn)下發(fā)，顆粒劑由江陰天江藥業(yè)生產(chǎn)，以10倍超純水溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至所需濃度，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊：衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20070181，取10 mg鹽酸多奈哌齊，加蒸餾水按照設(shè)定的給藥濃度配制成混懸液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。糞菌膠囊：南京希爾壽生物科技有限公司生產(chǎn)并提供，每粒內(nèi)含約0.1 g糞便劑量糞菌，由正常健康大鼠新鮮糞便按照標(biāo)準(zhǔn)制作流程，多次過濾，冷凍離心，沉淀取出后灌裝膠囊，制成后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑和儀器 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒，批號(hào)：NOVA-5144-03，美國(guó)Bioo Scientific公司；OMEGA-soil DNA Kit抽提，批號(hào)：R6842-02，美國(guó)Omega Bio-Tek公司；FastPfu Polymerase擴(kuò)增，批號(hào)：AP221-01，北京全式生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化，批號(hào)：AP-GX-500G，美國(guó)Axygen公司；PCR儀，ABI GeneAmp?9700型；SLY-Morris水迷宮系統(tǒng)，南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 取10只大鼠作為假手術(shù)組，其余60只大鼠采取目前公認(rèn)的雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎方法建立血管性認(rèn)知障礙模型。造模方法：手術(shù)前大鼠禁食12 h，不禁水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg麻醉后，將大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，取頸正中切口，鈍性剝離結(jié)締組織和頸前肌群，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組不結(jié)扎，其余大鼠分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈近端和遠(yuǎn)端，并從中間剪斷，以永久阻斷血流。傷口灑適量青霉素粉后縫合。手術(shù)過程中，保持大鼠自主呼吸，并保持肛溫(37±0.5)℃。手術(shù)21 d后,使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選血管性認(rèn)知障礙大鼠：以假手術(shù)組大鼠定位航行檢測(cè)的逃避潛伏期為參考值，造模完成的大鼠2次定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期平均值與假手術(shù)組大鼠參考值的比值高于1.2即認(rèn)為血管性認(rèn)知障礙模型造模成功。將造模成功的50只大鼠結(jié)合體重按照分層隨機(jī)的方法分為模型組、多奈哌齊組、通腦益智組、糞菌移植組、通腦益智聯(lián)合糞菌移植組，每組10只。為減少大鼠初始菌群對(duì)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及藥物的影響，同時(shí)減少混雜因素，在正式干預(yù)前對(duì)所有血管性認(rèn)知障礙大鼠腸道菌群進(jìn)行抗生素均一化處理，即給予硫酸新霉素和硫酸鏈霉素按照1∶1的比例配制成的混合溶液200 mg/kg連續(xù)灌胃6 d，假手術(shù)組大鼠同期給予等量的生理鹽水灌胃,均早晚各1次。之后假手術(shù)組和模型組均給予生理鹽水1 mL/100 g灌胃，多奈哌齊組給予多奈哌齊1 mg/(kg·d)灌胃，通腦益智組給予通腦益智顆粒方提取液9 g/(kg·d)灌胃(相當(dāng)于臨床成人劑量的等效劑量)，糞菌移植組每天給予2粒糞菌膠囊灌胃；通腦益智聯(lián)合糞菌移植組給予通腦益智顆粒方提取液及糞菌膠囊灌胃，各組均連續(xù)灌胃28 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)把水池分成4個(gè)象限，將平臺(tái)放置在第Ⅱ象限的中心。在水池中注入(22±2)℃的清水，水位高度超越平臺(tái)1～2 cm,并使用黑色墨水把水染黑以增強(qiáng)視頻的對(duì)比度。①定位航行實(shí)驗(yàn)：分別從平臺(tái)所在象限之外的不同入水點(diǎn)將大鼠放入水池，記錄大鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期。若大鼠在60 s結(jié)束時(shí)仍未找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記為60 s，并將老鼠帶領(lǐng)上平臺(tái)，停留10 s。每只大鼠每天進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每次間隔15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練4 d。②空間探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)完成后第2天，撤走原有平臺(tái)，并將大鼠從最遠(yuǎn)離原平臺(tái)位置放入水池，攝像自動(dòng)記錄60 s內(nèi)大鼠穿過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)及在原平臺(tái)區(qū)域停留時(shí)間和平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

1.5.2腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 隨機(jī)取每組7只大鼠的糞便，采用 16S rDNA生物信息技術(shù)完成腸道菌群結(jié)構(gòu)檢測(cè)分析(委托深圳微科盟生物科技有限公司檢測(cè))。根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進(jìn)行總DNA抽提，采用NanoDrop2000檢測(cè)DNA濃度和純度，采用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)、QuantiFluorTM-ST定量后，根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫。參照文獻(xiàn)[12-14],利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,之后基于OTU聚類分析結(jié)果進(jìn)行α及β多樣性指數(shù)分析，并基于分類學(xué)信息在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠逃避潛伏期比較 定位航行實(shí)驗(yàn)第4天時(shí)，模型組大鼠的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，多奈哌齊組、通腦益智組、糞菌移植組和通腦益智聯(lián)合糞菌移植組均較模型組明顯縮短(P均<0.05)，且腦益智聯(lián)合糞菌移植組明顯短于多奈哌齊組(P<0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較

2.2各組大鼠空間探索能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)，平臺(tái)目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間和平臺(tái)所在象限停留時(shí)間均明顯縮短(P均<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組、通腦益智組、糞菌移植組和通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯增加(P均<0.05)，通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠平臺(tái)目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間、平臺(tái)所在象限停留時(shí)間和通腦益智組平臺(tái)所在象限停留時(shí)間均明顯延長(zhǎng)(P均<0.05)；通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于多奈哌齊組(P<0.05)，平臺(tái)目標(biāo)區(qū)域停留時(shí)間、平臺(tái)所在象限停留時(shí)間均明顯長(zhǎng)于多奈哌齊組(P均<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠空間探索能力比較

2.3各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)α多樣性分析比較 物種稀釋曲線顯示實(shí)驗(yàn)樣本量充分，見圖1。模型組、多奈哌齊組、通腦益智組大鼠的OTU指數(shù)、Chaol指數(shù)和模型組Simpson指數(shù)均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠的OTU指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chaol指數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，各組間Shannon指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠腸道菌群α多樣性分析指數(shù)比較

2.4各組大鼠腸道菌群門水平相對(duì)豐度比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸道菌群中厚壁菌門相對(duì)豐度和藍(lán)藻菌門相對(duì)豐度明顯升高(P均<0.05)，擬桿菌門相對(duì)豐度、擬桿菌門/厚壁菌門比值和放線菌門相對(duì)豐度均明顯下降(P均<0.05)。與模型組比較，通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠腸道菌群中厚壁菌門相對(duì)豐度和藍(lán)藻菌門相對(duì)豐度均明顯下降(P均<0.05)，擬桿菌門相對(duì)豐度、擬桿菌門/厚壁菌門比值和放線菌門相對(duì)豐度均明顯升高(P均<0.05)。各組間變形菌門相對(duì)豐度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

圖1 根據(jù)假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠腸道菌群測(cè)序樣本的結(jié)果繪制而成的物種稀釋曲線

表4 假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠差異腸道菌群在門分類水平上相對(duì)豐度比較

2.5各組大鼠腸道菌群屬水平豐度聚類分析 根據(jù)大鼠腸道菌群測(cè)序結(jié)果，選取豐度前20的菌屬繪制成熱圖(見圖 2)，假手術(shù)組、通腦益智組、糞菌移植組和通腦益智聯(lián)合糞菌移植組所在分支距離近，聚類明顯，表明這4組間的微生物群落構(gòu)成在屬水平上最為接近；這4組所在分支與模型組和多奈哌齊組距離遠(yuǎn)，無明顯共同聚類，表明與模型組和多奈哌齊組組間菌屬構(gòu)成差異較大。

橫向?yàn)槊拷M樣品信息；縱向?yàn)槲锓N注釋信息圖2 假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠腸道菌群在屬分類水平上物種豐度聚類圖

2.6各組大鼠腸道微生物菌落構(gòu)成情況 根據(jù)各組樣本結(jié)果進(jìn)行PCoA分析(見圖3)，結(jié)果示模型組及多奈哌齊組間的距離較近，2組菌群結(jié)構(gòu)相似。與假手術(shù)組、通腦益智組、糞菌移植組和通腦益智聯(lián)合糞菌移植組菌群結(jié)構(gòu)與模型組及多奈哌齊組比較具有明顯差異，這4組之間距離接近，表明這4組之間的微生物群落構(gòu)成相似。

圖3 假手術(shù)組和血管性認(rèn)知障礙各組大鼠腸道菌群樣品PCoA分析

3 討 論

隨著腦卒中發(fā)病率的升高，血管性認(rèn)知障礙的患病率也明顯增高[15]。而血管性認(rèn)知障礙患者與常人相比更容易進(jìn)展為癡呆，從而嚴(yán)重?fù)p害患者的身心健康和生活質(zhì)量，加重其家庭與社會(huì)負(fù)擔(dān)[16]。近年來，根據(jù)“腦腸軸”理論，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)從而改善認(rèn)知的方法受到關(guān)注。大量研究認(rèn)為中藥可直接調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善微生態(tài)環(huán)境，使正常菌群健康的存活、生長(zhǎng)，進(jìn)而改善認(rèn)知障礙[7]；且腸道菌群可通過影響口服中藥在體內(nèi)的吸收、代謝、轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)中藥發(fā)揮療效[17-18]。通過中藥治療調(diào)整腸道菌群失衡狀態(tài)，促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)，并抑制致病菌，糾正失衡的腸道菌群，符合“扶正驅(qū)邪”的中醫(yī)治療原則[18-19]。另外糞菌移植是調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的重要手段，這與中醫(yī)藥多靶點(diǎn)的治療思路不謀而合。因此應(yīng)用中醫(yī)藥和糞菌移植聯(lián)合治療血管性認(rèn)知障礙有廣闊的應(yīng)用前景。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血管性認(rèn)知障礙屬“癡呆”范疇，病位在腦，與心、肝、脾、腎均有關(guān)，為本虛標(biāo)實(shí)之證，以腎虛為本，痰瘀火毒內(nèi)阻，上擾清竅，使神明不清為標(biāo)。通腦益智顆粒是由江蘇省中醫(yī)院全國(guó)名老中醫(yī)符為民教授依據(jù)血管性認(rèn)知障礙患者脾腎虧虛、毒瘀阻竅理論，以“益腎健脾、祛瘀泄毒”立法，總結(jié)60年臨床經(jīng)驗(yàn)而成，臨床研究證實(shí)其可改善輕中度血管性認(rèn)知障礙患者的認(rèn)知功能、日常生活能力，延緩病程的進(jìn)展[3]。

目前糞菌移植途徑主要分為上消化道、中消化道、下消化道3種，當(dāng)前多通過下消化道途徑經(jīng)結(jié)腸鏡移植，使糞菌群直達(dá)病所，治愈率更高[20]。但結(jié)腸鏡治療是有創(chuàng)性操作，不但插管過程痛苦，操作過程中還存在損傷消化道黏膜、出血甚至穿孔等風(fēng)險(xiǎn)，且不能滿足腸菌移植所需的多次操作，臨床應(yīng)用受到限制?？诜S菌制劑使用簡(jiǎn)便，患者依從性好，且研究證實(shí)口服糞菌膠囊治療艱難梭菌感染療效不亞于結(jié)腸鏡給藥[21]。

基于上述研究，本實(shí)驗(yàn)探討了通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植(糞菌膠囊)對(duì)血管性認(rèn)知障礙的影響及可能作用機(jī)制。結(jié)果Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，血管性認(rèn)知障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降；與模型組比較，多奈哌齊組、通腦益智組、糞菌移植組和通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，其中通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠逃避潛伏期縮短更明顯，且該組大鼠在穿越平臺(tái)等空間探索上表現(xiàn)更佳，這表明通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植在改善大鼠的空間學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力上有潛在優(yōu)勢(shì)。

腸道菌群中，厚壁菌門參與了肥胖、糖尿病、脂質(zhì)代謝等疾病的進(jìn)展，而肥胖和高血脂癥是腦卒中及認(rèn)知障礙發(fā)病的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[22-23]。擬桿菌門可促進(jìn)短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸的生成，短鏈脂肪酸缺乏會(huì)導(dǎo)致腸道功能紊亂，加重炎癥反應(yīng)，影響血腦屏障，最終會(huì)造成認(rèn)知障礙的加重[24-25]。放線菌門屬于益生菌；藍(lán)藻菌門具有神經(jīng)毒性，可通過引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，降解谷胱甘肽，造成神經(jīng)元凋亡[14，26]，誘導(dǎo)各種神經(jīng)退行性病變[27]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)c道菌群結(jié)構(gòu)α多樣性分析結(jié)果顯示，模型組大鼠的OTU指數(shù)、Chaol指數(shù)、Simpson指數(shù)均明顯低于假手術(shù)組，提示血管性認(rèn)知障礙大鼠腸道菌群的多樣性明顯降低；通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠的OTU指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chaol指數(shù)均明顯高于模型組，提示通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植可促進(jìn)大鼠腸道菌群多樣性恢復(fù)。腸道菌群門水平相對(duì)豐度分析顯示，模型組大鼠腸道菌群中厚壁菌門相對(duì)豐度和藍(lán)藻菌門相對(duì)豐度明顯升高，擬桿菌門相對(duì)豐度、擬桿菌門/厚壁菌門比值和放線菌門相對(duì)豐度均明顯下降，提示血管性認(rèn)知障礙組大鼠存在腸道菌群比例失調(diào)；與模型組比較，通腦益智聯(lián)合糞菌移植組大鼠腸道菌群中厚壁菌門相對(duì)豐度和藍(lán)藻菌門相對(duì)豐度均明顯下降，擬桿菌門相對(duì)豐度、擬桿菌門/厚壁菌門比值和放線菌門相對(duì)豐度均明顯升高，提示通腦益智顆粒聯(lián)合菌群移植能夠調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群紊亂，比單用多奈哌齊或通腦益智顆?；蚓阂浦仓委煾欣诰S持腸道微生態(tài)的平衡。在屬水平上，假手術(shù)組、通腦益智聯(lián)合糞菌移植組、糞菌移植組和通腦益智組所在分支距離最近，表明這4組之間的微生物群落構(gòu)成相似。因此推測(cè)通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植可能通過影響腸道微生物的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)菌群恢復(fù)平衡，使其逐漸趨向于健康大鼠腸道菌群，進(jìn)而改善大鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，通腦益智顆粒聯(lián)合糞菌移植能夠更好地調(diào)整大鼠腸道菌群群落豐度、多樣性及結(jié)構(gòu)，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而改善血管性認(rèn)知障礙大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮治療血管性認(rèn)知障礙作用。但目前靶向腸道微生物以及糞菌移植針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療機(jī)制仍不明確，且相關(guān)臨床研究還很缺乏，有待深入探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。