冬眠和非冬眠狀態(tài)達(dá)烏爾黃鼠腎單位及相關(guān)功能因子的比較

張修靜王恒鐘秋梅楊晨希,2王建禮,2*

（1北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021）（2國(guó)家民委黃河流域農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

腎臟是哺乳動(dòng)物的主要滲透調(diào)節(jié)和排泄器官，腎小球與血漿濾過功能有關(guān)，腎小管與水分的重吸收有關(guān)。腎臟結(jié)構(gòu)及機(jī)能與動(dòng)物的水代謝及棲息環(huán)境密切相關(guān)(張夢(mèng)和王德華，2018；袁江玲等，2019;Talmatamaret al.,2020)。有關(guān)嚙齒動(dòng)物腎臟適應(yīng)環(huán)境的研究較多，如對(duì)阿根廷平原鼠(Tympanoctomys barrerae)(Diaz and Ojeda,1999)、布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)、長(zhǎng)爪沙鼠(Meriones unguiculatus)、黑線倉(cāng)鼠(Cricetulus barabensis)(張夢(mèng)和王德華，2018)、子午沙鼠(Meriones meridianus)(袁江玲等，2019)、斯氏鼢鼠(Myospalax smithi)及棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)(劉瑩和王立志，2014)等的研究。腎臟形態(tài)指數(shù)和組織學(xué)指數(shù)可在一定程度上反映腎臟濃縮尿液的能力(張夢(mèng)和王德華，2018)。例如研究適應(yīng)典型干草原區(qū)的布氏田鼠和適應(yīng)干旱荒漠草原的達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilus dauricus)腎臟指數(shù)，發(fā)現(xiàn)前者腎臟濃縮尿液的能力比后者強(qiáng)，可能與冬眠使黃鼠逃避環(huán)境水荒的脅迫有關(guān)(劉志龍，1992)。在研究腎臟結(jié)構(gòu)適應(yīng)環(huán)境的同時(shí)，受全球氣候變暖的影響，關(guān)于腎臟水代謝調(diào)節(jié)機(jī)理的研究也受到了關(guān)注(王德華等，2021)。

腎臟對(duì)水的重吸收受多種因素調(diào)節(jié)，其中水通道蛋白(aquaporins,AQP)和抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)在調(diào)節(jié)水平衡中起著重要作用。腎臟是體內(nèi)AQP含量最高的組織，其中AQP1、AQP2和AQP3在腎臟的表達(dá)水平較高，在腎臟尿液生成、重吸收及濃縮過程中有重要作用(侯天德等，2011；黃祖賢，2012)。ADH由下丘腦的室旁核(paraventricular nucleus,PVN)和視上核(supraoptic nucleus,SON)神經(jīng)元合成，具有收縮血管和抗利尿的作用。ADH通過與V2型受體(V2R)結(jié)合介導(dǎo)AQP2以調(diào)控集合管和近端小管的重吸收和尿液的濃縮(Knepperet al.,2015)。干旱區(qū)生活的長(zhǎng)爪沙鼠通過ADH依賴的AQP2上調(diào)，促進(jìn)水分的重吸收(Xu and Wang,2016;Nouriet al.,2020)。一氧化氮(nitric oxide,NO)由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化產(chǎn)生。NO含量的變化主要取決于NOS的水平。其中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)在腎臟中含量較高，腎臟內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS催化產(chǎn)生的NO可抑制腎素分泌，還可抑制ADH促進(jìn)腎集合管對(duì)水的重吸收作用(Garcíaet al.,1996)。

冬眠是動(dòng)物應(yīng)對(duì)低溫、長(zhǎng)期禁食和禁水等不利條件的一種生存策略。動(dòng)物在冬眠期體溫降低，代謝率減少，心率、呼吸頻率大幅降低，腎臟血流量減少，尿的生成減少(Zancanaroet al.,1999;Janiet al.,2013)，在出眠期體溫恢復(fù)至接近正常水平，器官代謝快速恢復(fù)，但無(wú)代謝損傷(Janiet al.,2013)。因此，冬眠動(dòng)物已成為研究低溫缺血和缺血再灌注條件下腎臟結(jié)構(gòu)和功能適應(yīng)的天然模型，并對(duì)水鹽代謝障礙的研究具有重要意義。達(dá)烏爾黃鼠是一種典型的貯脂類冬眠動(dòng)物，冬眠期長(zhǎng)達(dá)5~6個(gè)月。目前已在冬眠模式、能量調(diào)節(jié)、生殖調(diào)節(jié)、骨骼肌適應(yīng)及社會(huì)行為等方面開展了研究(楊明等，2011；黨凱和高云芳，2016;Xinget al.,2016；王宇，2019；王恒等，2020)，但關(guān)于達(dá)烏爾黃鼠腎臟如何適應(yīng)冬眠的研究較少。為此，本研究比較了冬眠狀態(tài)(冬眠期)和非冬眠狀態(tài)(活動(dòng)期及出眠期)達(dá)烏爾黃鼠腎小管和腎小球的變化，血清肌酐、尿素和ADH的水平，并檢測(cè)了水通道蛋白基因(AQP1、AQP2和AQP3)、V2R和eNOS基因的表達(dá)，以期了解動(dòng)物從非冬眠狀態(tài)到冬眠狀態(tài)腎臟的水平衡調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

達(dá)烏爾黃鼠捕于寧夏鹽池縣惠安堡，分為夏季活動(dòng)期(7月上旬，6只)、冬眠期(12月下旬，6只)和早春出眠期(次年3月中旬，5只)，皆為成體。冬眠組于冬眠前捕獲，在室內(nèi)食物、飲水充足，使室內(nèi)溫度逐漸降為3℃~5℃，并且光照條件變?yōu)槿?，誘導(dǎo)其進(jìn)入冬眠狀態(tài)(Zancanaroet al.,1999;Sandoviciet al.,2004；孫 小 勇 等，2012)。

1.2 腎組織制片及參數(shù)測(cè)量

達(dá)烏爾黃鼠稱重后用2 mL(20%)的烏來糖麻醉，迅速摘取腎臟，去除腎周組織，用生理鹽水清洗干凈后以吸水紙吸去表面液體，固定于Bouin氏液，經(jīng)48 h固定后，采用常規(guī)石蠟切片，做矢狀切，片厚8 μm，HE染色，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片。

每只黃鼠取3張接近最大面積切片，在Motic Panthera U顯微鏡下用Motic Images Plus 3.0顯微成像系統(tǒng)測(cè)量和拍照。在65倍下，計(jì)數(shù)皮質(zhì)部2~3個(gè)視野一定面積下腎小球數(shù)目，并計(jì)算腎小球密度(ind./mm2)；近曲小管管壁上皮細(xì)胞胞體較大，細(xì)胞分界不清，細(xì)胞游離面具有發(fā)達(dá)的刷狀緣，故其管腔較小，形態(tài)不規(guī)則；遠(yuǎn)曲小管管徑相較于近曲小管細(xì)，管腔相對(duì)較大且規(guī)則，細(xì)胞界限較清楚，核近腔側(cè)。據(jù)此特點(diǎn)，測(cè)量并計(jì)算260倍下皮質(zhì)淺層、中層及髓旁近曲小管相對(duì)管徑[10×近曲小管管徑/(腎小體長(zhǎng)徑+短徑)/2]，皮質(zhì)淺層、中層及髓旁遠(yuǎn)曲小管相對(duì)管徑[10×遠(yuǎn)曲小管管徑/(腎小體長(zhǎng)徑+短徑)/2]，單位面積內(nèi)皮質(zhì)部近曲小管數(shù)/遠(yuǎn)曲小管數(shù)，以及近髓部近曲小管數(shù)/遠(yuǎn)曲小管數(shù)(袁江玲等，2019)。

1.3 血清肌酐、尿素和ADH濃度檢測(cè)

達(dá)烏爾黃鼠麻醉后心臟取血，4℃靜置1 h后，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液放置在標(biāo)記好的EP管中，-20°C冰箱保存。血清肌酐和尿素用全自動(dòng)生化分析儀(迪瑞CS-1200-1)檢測(cè)。ADH采用酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)檢測(cè)。

1.4 目的基因的表達(dá)

1.4.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

將存于液氮中的達(dá)烏爾黃鼠腎臟按照RNA提取試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]說明書提取總RNA。用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性，并用微量紫外分光光度計(jì)(Maestro NanoPr,MN-913A)檢測(cè)總RNA濃度(R=OD260/OD280，比值在1.8~2.0之間)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒[TaKa-Ra，寶生物工程(大連)有限公司]說明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃，15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)條件為85℃，5 s，得到的cDNA用于qPCR檢測(cè)。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)及特異性檢測(cè)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的北極黃鼠(Spermophilus parryii)、多紋黃鼠(Ictidomys tridecemlineatus)、黃腹旱獺(Marmota flaviventris)及阿爾卑斯旱獺(M.marmota)的相關(guān)序列，用Primer Premier 3.0和Oligo 7.0軟 件，設(shè) 計(jì)AQP1、AQP2、AQP3、V2R、eNOS和β-actin基因的引物序列(表1)。引物在北京新時(shí)代眾合科技有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物信息Table 1 Primers information used in the experiment

以腎臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：cDNA模板2.5 μL，上下游引物各1.5 μL，2×M5 HiPer plus Taq HIFI PCR 25 μL，ddH2O 19.5 μL。反應(yīng)程序：95℃，預(yù)變性3 min，PCR循環(huán)參數(shù)為94℃變性25 s，55℃退火25 s，72℃延伸10 s，共36個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)后用膠回收試劑盒將目的基因切膠純化，送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)NCBI中的Blast對(duì)獲得的核酸序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

1.4.3 目的基因的mRNA表達(dá)

用熒光定量梯度PCR儀(QT2.2，德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司)檢測(cè)腎臟AQP1、AQP2、AQP3、V2R和eNOS基因的表達(dá)?；驍U(kuò)增的特異性由熔解曲線保證。qPCR反應(yīng)體系為25 μL：cDNA1 μL，上游引物1 μL(10 μm/L)，下游引物1 μL(10 μm/L)，TB Green Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，PCR循環(huán)參數(shù)為95℃，變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。5個(gè)目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0處理，用單因素方差分析(One Way ANOVA)比較不同時(shí)期腎單位參數(shù)、目標(biāo)基因表達(dá)及血清肌酐、尿素和ADH濃度的差異，并用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 冬眠和非冬眠狀態(tài)達(dá)烏爾黃鼠腎單位的形態(tài)學(xué)比較

光學(xué)顯微鏡下觀察顯示達(dá)烏爾黃鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)致密，髓放線明顯，腎小囊腔隙較小。腎小體分布于皮質(zhì)淺層、中部和近髓部。近曲小管管徑不規(guī)則，遠(yuǎn)曲小管管腔較大且較規(guī)則(圖1)。單因素方差分析表明，不同時(shí)期皮質(zhì)淺層近曲小管相對(duì)管徑(RDPS)(F2,14=19.266,P＜0.001)、皮質(zhì)中層近曲小管相對(duì)管徑(RDPM)(F2,14=34.061,P＜0.001)、髓旁近曲小管相對(duì)管徑(RDPP)(F2,14=42.152,P＜0.001)、皮質(zhì)淺層遠(yuǎn)曲小管相對(duì)管徑(RDDS)(F2,14=100.955,P＜0.001)、皮質(zhì)中層遠(yuǎn)曲小管相對(duì)管徑(RDDM)(F2,14=106.727,P＜0.001)及髓旁遠(yuǎn)曲小管相對(duì)管徑(RDDP)(F2,14=174.198,P＜0.001)均表現(xiàn)出顯著差異，且均表現(xiàn)為活動(dòng)期最高，冬眠期次之，出眠期最低(P＜0.05)。不同時(shí)期皮質(zhì)部近曲小管數(shù)/遠(yuǎn)曲小管數(shù)(CPT/CDT)有顯著差異(F2,14=4.229,P=0.037)，冬眠期顯著低于活動(dòng)期和出眠期(P＜0.05)，活動(dòng)期和出眠期無(wú)顯著差異(P＞0.05)。近髓質(zhì)近曲小管數(shù)/遠(yuǎn)曲小管數(shù)(JPT/JDT)無(wú)組間差異(F2,14=3.075,P=0.078)。冬眠期和出眠期的腎小球密度(GD)顯著低于活動(dòng)期(F2,14=4.055,P=0.041)(表2)。

圖1 活動(dòng)期、冬眠期和出眠期達(dá)烏爾黃鼠腎臟的組織結(jié)構(gòu).a：腎臟矢狀切面(標(biāo)尺=1 000 μm)；b：腎臟皮質(zhì)(標(biāo)尺=100 μm)；c：腎臟髓質(zhì)(標(biāo)尺=100 μm)；d：夏季活動(dòng)期腎小球；e：冬眠期腎小球；f：早春出眠期腎小球；g：夏季活動(dòng)期皮質(zhì)部腎小管；h：冬眠期皮質(zhì)部腎小管；i：早春出眠期皮質(zhì)部腎小管；GL：腎小球；DT：遠(yuǎn)曲小管；PT：近曲小管.標(biāo)尺=20 μmFig.1 The renal histological structure of Daurian ground squirrels among the active,hibernating and arousal periods.a:Renal sagittal plane(Scale bar=1 000 μm);b:Renal cortex(Scale bar=100 μm);c:Renal medulla(Scale bar=100 μm);d:Glomerulus in summer active period;e:Glomerulus in winter hibernating period;f:Glomerulus in early spring arousal period;g:Cortical tubule in summer active period;h:Cortical tubule in winter hibernating period;i:Cortical tubule in early spring arousal period;GL:glomerulus;DT:distal convoluted tubule;PT:proximal convoluted tubule.Scale bar=20 μm

表2 活動(dòng)期、冬眠期和出眠期達(dá)烏爾黃鼠腎單位的組織學(xué)參數(shù)(mean±SE)Table 2 The histological parameters of nephrons in Daurian ground squirrels among the active,hibernating and arousal periods(mean±SE)

2.2 冬眠和非冬眠狀態(tài)達(dá)烏爾黃鼠血清肌酐、尿素和ADH濃度

達(dá)烏爾黃鼠血清肌酐(F2,14=8.101,P=0.005)、尿素(F2,14=5.154,P=0.021)和ADH(F2,14=28.024,P＜0.001)濃度具有季節(jié)差異。冬眠期血清肌酐和尿素濃度高于活動(dòng)期和出眠期(P＜0.05)，活動(dòng)期與出眠期無(wú)顯著差異(P＞0.05)。冬眠期ADH濃度較出眠期和活動(dòng)期明顯降低(P＜0.05)，出眠期與活動(dòng)期無(wú)顯著差異(P＞0.05)(圖2)。

圖2 活動(dòng)期、冬眠期和出眠期達(dá)烏爾黃鼠血清肌酐、尿素和ADH濃度.圖柱上不同字母代表顯著性差異，P＜0.05Fig.2 The concentrations of serum creatinine,urine and ADH of Daurian ground squirrels among the active,hibernating and arousal periods.Different letters on the columns indicate significant differences,P＜0.05

2.3 冬眠和非冬眠狀態(tài)達(dá)烏爾黃鼠腎臟AQP1、AQP2、AQP3、V2R和eNOS基因表達(dá)

方差分析結(jié)果表明，達(dá)烏爾黃鼠AQP1(F2,14=4.826,P=0.025)和AQP3(F2,14=28.103,P＜0.001)基因的表達(dá)具有季節(jié)效應(yīng)?；顒?dòng)期和冬眠期AQP1基因的表達(dá)高于出眠期(P＜0.05)；活動(dòng)期AQP3基因的表達(dá)顯著高于冬眠期和出眠期(P＜0.05)，冬眠期與出眠期無(wú)顯著差異(P＞0.05)。AQP2基因表達(dá)無(wú)顯著差異(F2,14=2.650,P=0.106)，但與活動(dòng)期相比，冬眠期和出眠期AQP2表達(dá)有降低的趨向；V2R基因表達(dá)有顯著差異(F2,14=4.114,P=0.039)，活動(dòng)期高于冬眠期(P＜0.05)，且出眠期與冬眠期相比有升高趨向。eNOS基因表達(dá)有顯著差異(F2,14=4.004,P=0.042)，出眠期顯著高于冬眠期與活動(dòng)期(P＜0.05)(圖3)。

圖3 活動(dòng)期、冬眠期和出眠期達(dá)烏爾黃鼠腎臟AQP1、AQP2、AQP3、V2R和eNOS基因的表達(dá).柱上不同字母代表顯著性差異，P＜0.05Fig.3 The renal gene expression of AQP1,AQP2,AQP3,V2R and eNOS in Duarian ground squirrels among the active,hibernating and arousal periods.Different letters on the columns indicate significant differences,P＜0.05

3 討論

3.1 腎單位對(duì)冬眠狀態(tài)的響應(yīng)

腎臟的基本功能單位是腎單位。腎單位由腎小體及與之相連的腎小管構(gòu)成，腎小體由腎小球和腎小囊組成。血液在腎臟皮質(zhì)部的腎小體中濾過形成原尿，之后流經(jīng)皮質(zhì)和髓質(zhì)的各級(jí)腎小管，經(jīng)過重吸收和分泌作用，最后以終尿的形式排出。顯微觀察表明冬眠期達(dá)烏爾黃鼠的腎皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎小體及腎小管結(jié)構(gòu)與其他時(shí)期一樣，完整且正常。對(duì)榛睡鼠(Muscardinus avellanarius)研究發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)在冬眠期保存完好，腎小管結(jié)構(gòu)正常，僅腎小球足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有輕微損傷(Zancanaroet al.,1999)。本研究中，冬眠期和出眠期達(dá)烏爾黃鼠的腎小球密度與活動(dòng)期相比下降。在對(duì)中國(guó)林蛙(Rana chensinensis)的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，冬眠期腎小體密度最小，隨后逐漸上升，夏季達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)(賈迪，2011)。對(duì)小鼠和小亞細(xì)亞沙鼠(Meriones shawi)研究表明，腎臟表型會(huì)響應(yīng)環(huán)境的變化(Hammond and Janes,1998;Elgotet al.,2018)。不同于冬眠，對(duì)干旱地區(qū)生活的小亞細(xì)亞沙鼠在室內(nèi)進(jìn)行水剝奪研究發(fā)現(xiàn)，其腎臟有增生現(xiàn)象，被認(rèn)為是腎臟節(jié)水的一種補(bǔ)償(Elgotet al.,2018)。有研究表明冬眠時(shí)腎小球?yàn)V過要么完全停止如黃鼠和睡鼠(Careyet al.,2003)，要么大幅減少如美洲黑熊(Ursus americanus)(Brownet al.,1971)。腎單位的濾過能力與腎小體或腎小球密度有關(guān)，因此，相對(duì)少的腎小球數(shù)量暗示腎臟對(duì)血液的濾過率減弱，腎小球功能降低。此外，本研究發(fā)現(xiàn)冬眠期皮質(zhì)部和髓旁近曲小管相對(duì)管徑和遠(yuǎn)曲小管相對(duì)管徑更窄，而且單位面積內(nèi)皮質(zhì)部近曲小管數(shù)與遠(yuǎn)曲小管數(shù)之比更少。近曲小管截面數(shù)更少說明其較短(袁江玲等，2019)。近曲小管和遠(yuǎn)曲小管具有重吸收水分的功能，較窄或較短的腎小管可能與冬眠期流經(jīng)腎小管的原尿及尿輸出的減少有關(guān)。進(jìn)入冬眠期的動(dòng)物為適應(yīng)環(huán)境，在機(jī)體及器官機(jī)能狀態(tài)上出現(xiàn)的某些變化，均與其形態(tài)學(xué)改變相適應(yīng)(郝泗城等，1994)。不同時(shí)期達(dá)烏爾黃鼠腎小球密度和腎小管相對(duì)管徑的變化可能是對(duì)濾過、水分重吸收及尿量生成的一種調(diào)節(jié)。

3.2 腎臟功能因子對(duì)冬眠狀態(tài)的響應(yīng)

通過測(cè)量血清肌酐可以間接反映腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate,GFR)，升高的血清肌酐能夠反映GFR下降(Janiet al.,2013)。本研究發(fā)現(xiàn)，冬眠期達(dá)烏爾黃鼠血清肌酐明顯升高，間接表明冬眠降低了GFR，GFR減少有利于水分保存，代表其生理上對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)。對(duì)榛睡鼠(Zancanaroet al.,1999)、歐洲黃鼠(Spermophilus citellus)(Sandoviciet al.,2004)、多紋黃鼠(Janiet al.,2011)和北極黃鼠(Riceet al.,2020)的研究也發(fā)現(xiàn)冬眠期血清肌酐增加，GFR減少。GFR的減少主要在于腎血液流量的減少(Janiet al.,2013)，例如，與活動(dòng)期相比，黑熊在冬眠期腎臟血液流量減少約36%，GFR減少約68%(Brownet al.,1971)，尿量減少95%(Riceet al.,2020)。一些研究發(fā)現(xiàn)冬眠動(dòng)物的腎臟有效腎血漿流量(effective renal plasma flow,ERPF)在正常值的5%~10%以下(Sandoviciet al.,2004)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)冬眠期達(dá)烏爾黃鼠血清尿素濃度較高。尿素是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，在肝臟合成，隨血液循環(huán)到達(dá)腎臟后被腎小球?yàn)V過清除，尿素含量除了可以反映腎功能，還在尿液濃縮過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，冬眠期(1月)榛睡鼠的血漿尿素氮較活動(dòng)期(6月)高(Zancanaroet al.,1999)。大鼠血清中尿素氮的濃度隨著禁水時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高，尿素的上升除受機(jī)體缺水的影響，也可能與攝食量減少和蛋白質(zhì)代謝增加有關(guān)(侯天德等，2011)。冬眠期的達(dá)烏爾黃鼠禁食和禁水時(shí)間較長(zhǎng)，致使血液中積累了較高水平的尿素。血清肌酐和尿素作為腎功能的常規(guī)指標(biāo)，其水平可以表示腎臟功能情況。與非冬眠狀態(tài)相比，冬眠的達(dá)烏爾黃鼠具有較低的腎功能。與此結(jié)果相似，冬眠的美洲黑熊歷經(jīng)數(shù)月的低腎功能和低代謝率，但沒表現(xiàn)出代謝損傷效應(yīng)(Srivastavaet al.,2019)。正如Andrews指出，冬眠是動(dòng)物組織器官應(yīng)對(duì)極端條件的一系列生理代謝性適應(yīng)，這些適應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致其偏離大多數(shù)動(dòng)物正常情況下的生理穩(wěn)態(tài)(Andrews,2019)。最近研究發(fā)現(xiàn)，冬眠期獨(dú)特的氮循環(huán)代謝途徑可提供必需和非必需氨基酸以合成蛋白質(zhì)并抑制氨的毒性(Riceet al.,2020)。

AQP是一組特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水的蛋白質(zhì)家族，幫助水分子快速通過細(xì)胞膜，參與水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡。對(duì)雙峰駝(Camelus bactrianus)、子午沙鼠和牦牛(Bos grunniens)的免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AQP1蛋白在腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)部位有大量表達(dá)，是腎臟近曲小管、髓袢與集合管水分重吸收的重要蛋白(黃祖賢，2012；張春燕等，2014；李娟等，2021)，高滲透壓可誘導(dǎo)其表達(dá)水平上升(黃祖賢，2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期3種AQP基因的表達(dá)并不同步。冬眠期AQP1和AQP2基因表達(dá)與活動(dòng)期無(wú)顯著差異，暗示冬眠期對(duì)水重吸收能力的維持。水分?jǐn)z入的減少會(huì)引起血漿鈉和滲透壓的增加，冬眠期動(dòng)物具有較高的血漿鈉離子濃度和滲透壓(Janiet al.,2013)，這可能維持了達(dá)烏爾黃鼠AQP1和AQP2基因的較高表達(dá)。干旱地區(qū)生活的達(dá)爾文葉耳鼠(Phyllotis darwini)、長(zhǎng)爪沙鼠和小亞細(xì)亞沙鼠在經(jīng)歷不同時(shí)長(zhǎng)的水剝奪后，與正常飲水組相比，腎皮質(zhì)的AQP2免疫活性蛋白上調(diào)(Gallardoet al.,2005;Xu and Wang,2016;Elgotet al.,2018)。該結(jié)果與本研究結(jié)果不同，暗示了活動(dòng)狀態(tài)下水剝奪后動(dòng)物的保水機(jī)制可能與冬眠狀態(tài)的保水機(jī)制有差異。有研究認(rèn)為活動(dòng)狀態(tài)下的水剝奪會(huì)迫使動(dòng)物改變代謝策略，誘導(dǎo)動(dòng)物增加食欲，促進(jìn)代謝水的生成(Takeiet al.,2012)。出眠期由于水分的再次攝入，滲透壓恢復(fù)可能引起AQP1基因表達(dá)的暫時(shí)性降低，AQP2基因的表達(dá)也有降低的趨向。活動(dòng)期AQP3基因的表達(dá)顯著高于冬眠期和出眠期，暗示其在夏季水分轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用。這可能與AQP3屬于水—甘油通道蛋白有關(guān)，其不僅允許水分子通過，還允許一些中性溶質(zhì)，比如甘油、二氧化碳及尿素等通過(Ishibashiet al.,2011；劉永輝等，2020)。

ADH作用于腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管，促進(jìn)對(duì)水分的重吸收，使尿液濃縮。血漿ADH升高，與腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管上的受體V2R特異結(jié)合，可促進(jìn)AQP2蛋白的表達(dá)，增加水的重吸收(Knepperet al.,2015；張廣霞等，2016)。本研究發(fā)現(xiàn)冬眠期達(dá)烏爾黃鼠血清ADH濃度和腎臟V2R基因表達(dá)較活動(dòng)期降低，出眠期有恢復(fù)升高的趨向，可能與冬眠期禁水、排尿減少有關(guān)。由于ADH還具有使血壓升高的功能，因此，血壓降低也可能是冬眠期ADH下降的一個(gè)原因。對(duì)多紋黃鼠的研究也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，與活動(dòng)狀態(tài)相比，冬眠狀態(tài)的多紋黃鼠血漿ADH減少，蘇醒后又恢復(fù)到正常水平。這與冬眠期腎功能降低一致，此時(shí)GFR最小，ADH的作用被認(rèn)為不是必要的。蘇醒后血壓和腎功能恢復(fù)到活動(dòng)水平，且產(chǎn)生和分泌尿液，此時(shí)需要ADH的抗利尿作用(Fenget al.,2019)。研究發(fā)現(xiàn)小亞細(xì)亞沙鼠經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的水剝奪后PVN和SON的ADH蛋白表達(dá)增加(Elgotet al.,2018)，這些發(fā)現(xiàn)再次暗示了動(dòng)物在活動(dòng)狀態(tài)下水剝奪的水平衡調(diào)節(jié)機(jī)制可能與冬眠時(shí)的調(diào)節(jié)機(jī)制不同。

腎臟中eNOS產(chǎn)生的NO是關(guān)鍵的血管舒張因子和保護(hù)因子。免疫組織化學(xué)研究表明，與活動(dòng)期相比，冬眠期和出眠期歐洲黃鼠腎小球的eNOS蛋白表達(dá)顯著減少，但組織間隙的eNOS蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，后者暗示了管周血量供應(yīng)的維持(Sandoviciet al.,2004)。本研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)烏爾黃鼠冬眠期和活動(dòng)期腎組織的eNOS基因表達(dá)無(wú)顯著變化，但出眠期eNOS基因表達(dá)明顯升高，暗示出眠期腎血流的恢復(fù)性供應(yīng)可能影響了eNOS蛋白的合成。動(dòng)物在冬眠期會(huì)通過自身的調(diào)節(jié)和內(nèi)源性產(chǎn)熱機(jī)制周期性地覺醒，返回到常溫狀態(tài)，整個(gè)睡眠被若干次短暫的陣間覺醒分隔(楊明等，2011)。如達(dá)烏爾黃鼠每次陣間覺醒時(shí)長(zhǎng)平均為1.36 d(孫小勇等，2012)，北極黃鼠陣間覺醒時(shí)長(zhǎng)為12~24 h(Karpovichet al.,2009)。陣間覺醒期間腎臟ERPF、GFR及尿的生成會(huì)快速而短暫地恢復(fù)(Sandoviciet al.,2004;Janiet al.,2013;Riceet al.,2020)。因此，不能排除陣間覺醒對(duì)上述基因表達(dá)的影響。

綜上所述，本研究中腎單位、血清肌酐和尿

素的變化暗示達(dá)烏爾黃鼠在冬眠狀態(tài)下具有較低的腎功能。達(dá)烏爾黃鼠活動(dòng)期、冬眠期和出眠期腎臟AQP1、AQP3及V2R基因表達(dá)的差異暗示其在水平衡調(diào)節(jié)方面對(duì)冬眠與非冬眠狀態(tài)的生理性適應(yīng)。這些可塑性反應(yīng)與動(dòng)物活動(dòng)期、冬眠期及出眠后腎血流量、腎灌注壓及尿生成的周期性變化有關(guān)。本研究結(jié)果增進(jìn)了對(duì)動(dòng)物腎臟適應(yīng)冬眠這一特殊習(xí)性的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)美洲黑熊冬眠(晚秋)與出眠(早春)相比，腎臟中有169個(gè)編碼的基因有差異性表達(dá)，其中101個(gè)基因下調(diào)，68個(gè)基因上調(diào)(Srivastavaet al.,2019)。因此，動(dòng)物腎臟對(duì)冬眠的生理性適應(yīng)，涉及到多種基因表達(dá)的變化，可能需要多種調(diào)節(jié)因子的整合，關(guān)于這一問題還需進(jìn)一步研究。