6種殺菌劑對梨火疫病菌的室內(nèi)毒力測定和混配試驗

劉朋飛,王 巖,王泓力,吳曰福,陳小飛,樓兵干*

(1.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點實驗室,杭州 310058;2.新疆林業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代林業(yè)研究所,烏魯木齊 830002;3.塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院,阿拉爾 843300)

由解淀粉歐文氏菌Erwiniaamylovora引起的梨火疫病是梨、蘋果等薔薇科仁果類植物上的一種毀滅性細(xì)菌病害,是重要的國際植物檢疫性病害[1]。病原菌通常從幼嫩組織的自然孔口侵染,侵染初期花、嫩梢和幼果有水漬狀病斑,氣候濕潤時有菌膿滲出,后變黑枯萎,如果不及時在病健交界以下30～50 cm剪除病枝,采取有效藥劑進(jìn)行防治,病原菌會繼續(xù)沿枝條上下擴(kuò)展,當(dāng)年即可導(dǎo)致大枝枯死或整株死亡。

梨火疫病自18世紀(jì)80年代在美國紐約州首次發(fā)現(xiàn)至今,已傳播至全球50多個國家和地區(qū)[2],近年來,我國新疆和甘肅也有梨火疫病發(fā)生[3],嚴(yán)重威脅著我國梨、蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。梨火疫病防控措施除了加強(qiáng)檢驗檢疫,嚴(yán)禁從病區(qū)調(diào)運(yùn)苗木與接穗外,對老病區(qū)和常發(fā)區(qū),國內(nèi)外采取的主要防控措施是化學(xué)藥劑防控。國際上使用的化學(xué)藥劑主要有兩大類:抗生素類如硫酸鏈霉素、土霉素、春雷霉素等,銅制劑類如堿式硫酸銅、氫氧化銅、王銅等[4]。鏈霉素兼具預(yù)防和治療效果,防治效果穩(wěn)定,在推薦使用濃度下對花、果和葉片安全,是梨火疫病防治的主要藥劑,但抗性菌株的出現(xiàn)和出于對人類健康安全考慮,一些國家禁止和限制鏈霉素的大田使用[4-8],我國于2018年6月農(nóng)用硫酸鏈霉素已全面禁用[9]。銅制劑尤其是無機(jī)銅在有效防控濃度下對花、葉和果實易產(chǎn)生藥害,在使用上受到一定限制。雖然還沒有梨火疫病菌對銅制劑產(chǎn)生抗性的報道,但已有其他多種植物病原細(xì)菌對銅制劑抗性的報道,不能排除梨火疫病菌對銅制劑出現(xiàn)抗藥性的可能性[7]。Georg等對29種藥劑進(jìn)行了梨火疫病防效測定,結(jié)果沒有篩選出比鏈霉素更有效的藥劑[10]。篩選新的有效藥劑,創(chuàng)制新的復(fù)配藥劑,提高防控效果,降低抗藥性風(fēng)險是梨火疫病防控的當(dāng)務(wù)之急。本研究對目前廣泛應(yīng)用于植物細(xì)菌性病害防治的6種殺菌劑及其復(fù)配藥劑進(jìn)行梨火疫病菌室內(nèi)毒力測定和在盆栽杜梨苗上進(jìn)行防效試驗,以期篩選出新的防治梨火疫病的有效藥劑單劑和復(fù)配劑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

梨火疫病菌XJSZ0102,由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所分離,經(jīng)系統(tǒng)鑒定并保存于-70℃冰箱中。

1.2 供試藥劑

供試殺菌劑包括6種原藥和6種制劑。6種原藥分別為:76.1%春雷霉素(日本北興化學(xué)工業(yè)株式會社)、95%噻唑鋅(浙江新農(nóng)化工股份有限公司)、97%喹啉銅[興農(nóng)藥業(yè)(中國)有限公司]、12%中生菌素(福建凱立生物制品有限公司)、98%丙硫唑(貴州道元生物技術(shù)有限公司)、50%芬母肽(江蘇嘉泰生物技術(shù)有限公司);6種制劑分別為:40%春雷·噻唑鋅懸浮劑、20%噻唑鋅懸浮劑，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；45%春雷·喹啉銅懸浮劑、33.5%喹啉銅懸浮劑，興農(nóng)藥業(yè)(中國)有限公司；2%春雷霉素水劑，江門市植保有限公司；10%丙硫唑懸浮劑，貴州道元生物技術(shù)有限公司。

1.3 供試杜梨苗

2018年秋移栽健康無病蟲為害的一年生杜梨苗到苗盆(盆高20 cm,內(nèi)徑16 cm)中,置于新疆庫爾勒市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局育苗中心3號大棚內(nèi),生長季7～14 d澆1次透水,一個月施1次復(fù)合肥,2020年冬季平茬,2021年4月份新生枝條長至15 cm左右供試驗用。

1.4 試驗方法

1.4.1接種菌液的制備

從活化的平板上挑取梨火疫病菌單菌落到50 mL 營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基中,28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。使用紫外可見光分光光度計測定菌懸液600 nm波長(OD600)吸光度,使用NB培養(yǎng)基稀釋菌懸液至1×109cfu/mL (OD600為0.4±0.01)。

1.4.2殺菌劑原藥溶解方法

95%噻唑鋅原藥先用適量二甲亞砜溶解,再用0.1%吐溫-80稀釋;98%丙硫唑原藥先用適量冰醋酸溶解,再用0.1%吐溫-80稀釋;97%喹啉銅原藥先用適量三氯甲烷溶解,再用0.1%吐溫-80稀釋;76.1%春雷霉素原藥、12%中生菌素原藥和50%芬母肽原藥用無菌水溶解,使用0.22 μm無菌過濾器過濾后再用無菌水稀釋。所有用于溶解原藥的有機(jī)溶劑在培養(yǎng)基中的使用濃度都低于0.1%,在預(yù)試驗中對梨火疫病菌生長的影響在統(tǒng)計誤差范圍內(nèi)可忽略不計。

1.4.3殺菌劑原藥對梨火疫病菌的毒力測定

采用比濁法室內(nèi)測定6種殺菌劑對梨火疫病菌的毒力[11]。根據(jù)預(yù)試驗,將6種殺菌劑原藥稀釋后加入到50 mL NB培養(yǎng)基中配成5個供試濃度(表1)。每個濃度設(shè)3個重復(fù),每個重復(fù)1瓶,吸100 μL稀釋100倍的接種菌液于含藥培養(yǎng)基中,以相同濃度的含藥培養(yǎng)基中加入等量無菌水代替菌懸液為組內(nèi)空白對照。陽性對照以等量無菌水代替藥劑,陰性對照以等量無菌水代替藥劑和菌懸液。在28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后測定培養(yǎng)液OD600增加值(ΔOD600,用組內(nèi)空白對照調(diào)零后測定本組含藥培養(yǎng)液的OD600)。

1.4.4混配藥劑聯(lián)合毒力測定

基于6種殺菌劑對梨火疫病菌的毒力結(jié)合每種殺菌機(jī)理,形成7個類別35種混配方案,采用比濁法進(jìn)行聯(lián)合毒力測定[12]。每種配比設(shè)5個供試濃度(表2),每個濃度設(shè)3個重復(fù),每個重復(fù)1瓶,吸100 μL稀釋100倍的接種菌液于含藥培養(yǎng)基中,以相同濃度的含藥培養(yǎng)基中加入等量無菌水代替菌懸液為組內(nèi)空白對照。陽性對照以等量無菌水代替藥劑,陰性對照以等量無菌水代替藥劑和菌懸液。在28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后測定培養(yǎng)液的ΔOD600,計算各混劑對梨火疫病菌的生長抑制率。

1.4.5在大棚盆栽杜梨苗上測定7種殺菌劑的防效

試驗分兩組,一組為預(yù)防試驗,一組為治療試驗,每組設(shè)9個處理,包括7個藥劑處理、1個接菌對照和1個空白對照。每個處理3個重復(fù),每個重復(fù)10盆杜梨苗,為當(dāng)年生枝條,在試驗前5 d,修剪掉過長或過短的枝條,留下長勢均勻一致長約15 cm的枝條。預(yù)防組先噴藥,48 h后噴菌并覆膜保濕48 h;治療組先噴菌并覆膜保濕48 h再噴藥。根據(jù)供試藥劑毒力測定結(jié)果結(jié)合生產(chǎn)廠家推薦使用倍數(shù)確定供試濃度(表3),每個處理用藥量約1 L,噴至枝葉上藥液懸而未滴;接菌采用噴霧方式,接菌濃度為1×109cfu/mL,接菌量約10 mL/盆。以只接菌不做藥劑處理的為接菌對照,以既不接菌也不做藥劑處理的為空白對照。

根據(jù)浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所樓兵干教授制定的梨火疫病溫室盆栽杜梨苗病情分級標(biāo)準(zhǔn)對接菌后14 d的盆栽苗進(jìn)行調(diào)查,統(tǒng)計各病級發(fā)病枝條數(shù)。梨火疫病溫室盆栽杜梨苗病級分級標(biāo)準(zhǔn):0級,無病斑;1級,病斑長度占總枝條長度1/3及以下;3級,病斑長度占總枝條長度1/3以上,不超過2/3;5級,病斑長度占總枝條長度2/3以上。

1.4.6數(shù)據(jù)處理

根據(jù)公式(1)計算殺菌劑在室內(nèi)對梨火疫病菌的生長抑制率。把殺菌劑濃度換算成對數(shù)值作為自變量x,把生長抑制率換算成抑制率幾率值作為因變量y,使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行回歸分析,比較殺菌劑之間對梨火疫病菌的毒力差異。

生長抑制率=

(1)

根據(jù)公式(2)～(4)計算混劑的共毒系數(shù)(CTC)[12],根據(jù)CTC來評價藥劑混配的增效作用,即CTC≥120時該復(fù)配劑表現(xiàn)增效,CTC≤80表現(xiàn)為拮抗,80

(2)

混劑理論毒力指數(shù)=TIA×PA+TIB×PB

(3)

式中TIA為A藥劑的毒力指數(shù),PA為A藥劑在混劑中的百分含量,TIB為B藥劑的毒力指數(shù),PB為B藥劑在混劑中的百分含量。

(4)

根據(jù)公式(5)(6)計算盆栽杜梨苗病情指數(shù)和殺菌劑在盆栽苗上對梨火疫病的防治效果。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計分析軟件完成數(shù)據(jù)分析。

病情指數(shù)=

(5)

防治效果=

(6)

2 結(jié)果與分析

2.1 6種殺菌劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

室內(nèi)毒力測定結(jié)果(表1)表明:6種殺菌劑對梨火疫病菌都有生物活性。丙硫唑、芬母肽和中生菌素的EC50均低于1 mg/L,表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒力;春雷霉素和噻唑鋅的EC50大于1 mg/L小于50 mg/L,表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒力;喹啉銅的EC50大于100 mg/L,毒力最弱。毒力方程的斜率反映了藥劑對病原菌的急性毒作用帶,斜率越大急性毒作用帶越小,表示藥效越好[13]。供試6種殺菌劑中梨火疫病菌急性毒作用帶最小的藥劑是芬母肽,其次是丙硫唑,中生菌素急性毒作用帶最大。

表1 6種殺菌劑對梨火疫病菌的室內(nèi)毒力測定Table 1 The toxicity of six single fungicides to Erwinia amylovora

2.2 混劑聯(lián)合毒力測定結(jié)果

聯(lián)合毒力測定結(jié)果(表2)表明:在供試的7類混劑中,春雷霉素和喹啉銅復(fù)配的5種混劑共毒系數(shù)均大于120,表現(xiàn)出增效作用;芬母肽和中生菌素復(fù)配的5種混劑共毒系數(shù)均小于80,表現(xiàn)出拮抗作用。在組成的35種混劑中,3個類別的9種混劑具有增效作用,其中增效最顯著的混劑是春雷霉素∶喹啉銅=1∶9,CTC值為184,春雷霉素∶噻唑鋅=1∶7的增效作用最弱,CTC值為120;8種混劑具有拮抗作用;18種混劑具有相加作用。

2.3 盆栽杜梨苗上防效測定結(jié)果

在具有增效作用的3類混劑中分別選擇最優(yōu)配比的混劑:40%春雷·噻唑鋅懸浮劑(春雷霉素∶噻唑鋅=1∶7)、45%春雷·喹啉銅懸浮劑(春雷霉素∶喹啉銅=1∶9)和2.1%丙硫·春雷懸浮劑(丙硫唑∶春雷霉素=1∶11),以及4種組成混劑的單劑在盆栽杜梨苗上測定對梨火疫病的防治效果。結(jié)果表明:3種混劑的預(yù)防效果和治療效果均顯著好于單劑(表3)。效果最好的是40%春雷·噻唑鋅懸浮劑,預(yù)防效果和治療效果分別為84.58%和74.37%;效果最差的是33.5%喹啉銅懸浮劑,預(yù)防效果和治療效果分別為為40.88%和37.89%。

3 結(jié)論與討論

本研究測定了6種殺菌劑原藥對梨火疫病菌的毒力,結(jié)果除喹啉銅的EC50大于100 mg/L,毒力較弱外,其他5種殺菌劑都有較高的生物活性,其中芬母肽、丙硫唑和中生菌素生物活性最高。噻唑鋅、中生菌素和芬母肽是我國近年來自主研發(fā)的創(chuàng)制藥劑。噻唑鋅對水稻白葉枯病、水稻細(xì)菌性條斑病等細(xì)菌性病害有很好的防治效果[14-15];室內(nèi)毒力測定顯示,中生菌素對核桃細(xì)菌性黑斑病菌Xanthomonasarboricolapv.juglandis、獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringae有較好的生物活性,并且在田間對番茄潰瘍病表現(xiàn)出較好的防治效果[16-18];芬母肽屬于抗菌肽類殺菌劑,通過物理作用破壞細(xì)胞膜達(dá)到殺菌效果,對多種動植物病原細(xì)菌有很好的殺菌效果[19]。丙硫唑最早在臨床上用于治療蠕蟲感染引起的疾病,后研究發(fā)現(xiàn)對多種植物病原真菌有較好的生物活性,在細(xì)菌性病害上的研究較少[20]。喹啉銅是銅制劑類的后起之秀,比堿式硫酸銅、氫氧化銅等無機(jī)銅更安全,對大麥條紋病、馬鈴薯瘡痂病等多種病害有較好的防效[21-22]。上述5種藥劑多數(shù)為近20年國內(nèi)農(nóng)藥領(lǐng)域新的高效低毒藥劑,在國際上很少有用于防治梨火疫病的文獻(xiàn)報道。已有研究表明春雷霉素對梨火疫病菌的最低抑菌濃度為3.5～18.3 mg/L,EC95為6.9～46.7 mg/L[23],本研究結(jié)果與之一致。我們將春雷霉素和其他5種藥劑的EC50比較,結(jié)果證明了各藥劑對梨火疫病菌的有效性。

藥劑聯(lián)合毒力測定結(jié)果表明:所測試的7類35種混劑中只有3類9種藥劑有增效作用。藥劑混配通常有混劑和桶混兩種方式?；靹┦怯赊r(nóng)藥生產(chǎn)廠家研發(fā)的含有兩種及以上有效成分的農(nóng)藥制劑,桶混則是在田間施藥時將幾種單劑按比例配成混合藥液。好的藥劑混配不僅擴(kuò)大了防治譜,降低了抗藥性風(fēng)險,同時具有增效作用,降低用藥量,減少施藥次數(shù)[24]。不是所用的藥劑混配都具有增效作用,多數(shù)藥劑混配表現(xiàn)出藥效的相加,部分藥劑混配后甚至表現(xiàn)出拮抗作用,本研究中芬母肽與中生菌素混配后就出現(xiàn)藥劑間的拮抗作用。在田間施藥時不能隨意對不同藥劑進(jìn)行混配,以免出現(xiàn)藥效降低的現(xiàn)象。藥劑混配的效果不僅與藥劑種類有關(guān),也與混配比例相關(guān),本研究中,春雷霉素和噻唑鋅混配只有在春雷霉素∶噻唑鋅=1∶7時有增效作用,其他比例都表現(xiàn)出相加作用,說明在混劑的研發(fā)過程中,混配比例至關(guān)重要,只有最佳的混配比例才能使混劑的藥效發(fā)揮得最好。

表3 7種殺菌劑在盆栽杜梨苗上對梨火疫病的防治效果1)Table 3 Effects of seven fungicides against pear fire blight disease on potted seedlings

藥劑Fungicide有效濃度/mg·L-1Effectiveconcentration預(yù)防試驗Preventivetrial病情指數(shù)Diseaseindex預(yù)防效果/%Protectiveeffect治療試驗Therapeutictrial病情指數(shù)Diseaseindex治療效果/%Treatmenteffect40%春雷·噻唑鋅SCkasugamycin·zincthiazole40%SC333(9.29±0.42)f84.58(15.01±0.67)g74.3745%春雷·喹啉銅SCkasugamycin·oxine-copper45%SC300(9.84±0.14)f83.66(17.09±0.18)f70.822.1%丙硫·春雷SCalbendazole·kasugamycin2.1%SC133(13.90±0.27)e76.92(20.48±0.15)e65.032%春雷霉素ASkasugamycin2%AS40(19.90±0.51)c66.96(24.30±0.46)c58.5033.5%喹啉銅SCoxine-copper33.5%SC419(35.61±0.66)b40.88(36.37±0.60)b37.8920%噻唑鋅SC zincthiazole20%SC500(19.69±0.49)c67.31(24.47±0.87)c58.2110%丙硫唑SC albendazole10%SC167(18.37±0.28)d69.50(22.87±0.93)d60.95接菌對照 Inoculationcontrol-(60.23±0.50)a-(58.56±1.77)a-空白對照 Blankcontrol-(0.00±0.00)g-(0.00±0.00)h-

大棚中盆栽杜梨苗上防治試驗結(jié)果表明:篩選和混配的藥劑對梨火疫病有一定防效且防效差異顯著,混劑的防治效果顯著好于單劑。藥劑的大田防治效果不僅與殺菌劑有效成分的生物活性有關(guān),還與藥劑劑型加工有關(guān)[25]。為便于生產(chǎn)中應(yīng)用,本研究所使用的單劑和混劑盡量選用市面上已有的商業(yè)化產(chǎn)品進(jìn)行試驗。40%春雷·噻唑鋅懸浮劑是2015年國內(nèi)新上市的產(chǎn)品,對水稻細(xì)菌性條斑病、水稻白葉枯病等都有較好的防治作用[26-27]。45%春雷·喹啉銅懸浮劑主要用于防治芒果、西瓜、黃瓜等作物的細(xì)菌性角斑病以及柑橘潰瘍病等。上述兩種藥劑之前并未有梨火疫病防治方面的相關(guān)報道。本研究通過室內(nèi)毒力測定、盆栽防效測定,明確了兩種復(fù)配劑對梨火疫病的防治效果。丙硫唑和春雷霉素目前還沒有商品化復(fù)配劑,本研究所用的藥劑為使用現(xiàn)有單劑臨時混配,雖然混劑在盆栽試驗上表現(xiàn)出較好的防效,但作為制劑,還沒有經(jīng)過最佳的助劑配比和生產(chǎn)工藝研發(fā),其防效有進(jìn)一步提升的空間。