伴腎小球薄基膜改變的IgA腎病非膠原Ⅳ基因變異分析

徐 華，余學(xué)問，梁瑩瑩，李 蕓，曾又佳，張 露，徐洲穩(wěn)，李 霞，邵牧民

IgA腎病在原發(fā)性腎小球疾病中占25%～50%。Qazi等[1]報道約19%的薄基膜病伴IgA腎病，2018年國際膠原Ⅳ相關(guān)腎病建議性新分類指出既往認為薄基膜病預(yù)后良好的觀點需改變，也有文獻報道合并高血壓或肥胖等臨床因素的薄基膜病預(yù)后不良[2-3]。近年，IgA腎病中腎小球薄基膜情況逐漸得以重視。約40%薄基膜病存在膠原Ⅳ基因變異[4-7]，本組前期實驗發(fā)現(xiàn)約6%的IgA腎病伴薄基膜病，部分具有膠原Ⅳ基因變異，非膠原Ⅳ基因變異情況尚不清楚。本實驗利用全外顯子組及Sanger測序技術(shù)篩選伴薄基膜改變的IgA腎病的變異基因，并對候選變異基因進行致病性評估，首次探索該類疾病中非膠原Ⅳ基因的變異及臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集深圳市中醫(yī)院病理科診斷的6例伴薄基膜改變的IgA腎病，患者年齡34～52歲，中位年齡41歲。根據(jù)臨床表現(xiàn)、病理學(xué)形態(tài)、免疫熒光及透射電鏡檢查，按照本電鏡室建立的正常成人腎小球基膜厚度標準[(340±70) nm]直接測量基膜厚度，結(jié)合文獻關(guān)于薄基膜病變評估標準[8-9]，本實驗定義基膜厚度小于270 nm為薄基膜改變。收集患者臨床信息包括：年齡、性別、家族史，做腎臟病理穿刺活檢及近期隨訪時的血尿、蛋白尿、腎功能指標、血壓，腎外表現(xiàn)如聽力、眼、神經(jīng)發(fā)育及運動功能給予相應(yīng)專科檢查，腎臟影像學(xué)檢查確定有無囊腫、畸形或發(fā)育異常，排除其它系統(tǒng)性疾病。本實驗經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查及批準(批件號K2019-027-01)，患者均知情同意。

1.2 免疫熒光和免疫組化冷凍組織5 μm厚切片，以FITC羊抗人熒光抗體行直接免疫熒光染色，檢測腎組織中IgG、IgA、IgM、C3、C1q、Fibrinogen、Kappa、Lambda(Dako公司)沉積部位、強度和分布特點。FN免疫組化染色采用EnVision法。穿刺組織2 μm厚切片脫蠟至水，EDTA熱修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA室溫封閉，染色步驟采用Leica bond-Ⅲ全自動免疫組化儀按操作說明書進行，一抗為Fibronectin(RAB-0071，福州邁新公司)，二抗為Leica原裝，DAB染色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片觀察。

1.3 全外顯子組測序及變異分析提取外周血單個核細胞總DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN公司，德國)，制備文庫，對外顯子及臨近剪切區(qū)捕獲和富集，使用BGI-MGISEQ-2000高通量測序平臺進行檢測?？傮w覆蓋度為95%，目標區(qū)平均測序深度>110X。測序片段通過BWA與UCSC hg19人類參考基因組比對，使用GATK(GenomeAnalysis Tool kit)行堿基質(zhì)量值校正SNV及INDEL。對照變異數(shù)據(jù)庫(dbSNP，1000 genome，ESP6500，GnomAD等)得到過濾后的突變頻率，僅列出頻率小于1%的變異。ClinVar(www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、OMIM(www.omim.org)、HGMD(www.hgmd.org)疾病數(shù)據(jù)庫檢索，采用Phylop(compgen.bscb.cornell.edu/phast)同源序列多重比對物種間保守性。根據(jù)檢索文獻及數(shù)據(jù)庫，重點篩選腎小球基膜、足細胞及蛋白尿相關(guān)基因的變異。利用SIFT(sift.jcvi.org)、Polyphen2(genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、MutationTaster(www.mutationtaster.org)、CADD(cadd.gs.washington.edu)、Varsome(varsome.com)功能學(xué)分析平臺，參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)會(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)標準，進行變異的致病性注釋。按照人類基因組組織基因命名委員會(HGNC)及人類基因組變異學(xué)會(HGVS)規(guī)范命名。

1.4 Sanger測序驗證FN1引物序列：上游5′-CAGTGAGGTAGGCAGGGAAG-3′，下游5′-TTT TAGCCAGACCCCAGATG-3′；上游5′-GGCTCCGTT GAATGGACTT-3′，下游5′-CCAAATAAAATGTT GAGGGA-3′；NUP160引物序列：上游5′-AGACTGA CAACCCATACA-3′，下游5′-GTTCCCGCAGAT AGAGT-3′；ITGA3引物序列：上游5′-TCTC CCCGCTCCAGTTC-3′，下游5′-TGGGTCCATTTGT TATCC-3′。擴增條件：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性20 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，合計35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)分離純化后使用ABI3730xl測序儀測序，使用Phred/phrap軟件進行SNP分析，使用SeqMan軟件進行序列比對，使用Chromas軟件查看峰圖。

1.5 氨基酸鏈空間結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析采用SwissModel(www.swissmodel.expasy.org)平臺分析FN1突變位點對應(yīng)的氨基酸鏈空間結(jié)構(gòu)位置，用IBS.Biocuckoo(ibs.biocuckll.org/)軟件構(gòu)建FN1蛋白結(jié)構(gòu)域圖，采用String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(string-db.org/)分析FN1、NUP160、ITGA3蛋白之間的交互作用。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征例1女性，37歲，以間斷肉眼血尿入院。隱血3+，尿蛋白2+，尿蛋白1 412 mg/24 h，肌酐87.8 μmol/L，ANA譜、ANCA、免疫、肝功能、電解質(zhì)、凝血功能、血糖、血脂、風濕、血沉、抗磷脂酶A2受體抗體、β2微球蛋白、血免疫固定電泳、自身免疫性血管炎抗體檢測均陰性；伴皮膚斑丘疹，未見聽力、眼等腎外異常；未發(fā)現(xiàn)囊腫、畸形或泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育異常；骨骼系統(tǒng)及神經(jīng)發(fā)育未見異常；否認家族腎病史。后經(jīng)ACEI類藥物及中藥方劑治療后，隨訪時尿蛋白減少，最低491.4 mg/24 h，血肌酐83 μmol/L。例2女性，34歲，以體檢尿檢異常入院。隱血+，尿蛋白波動1+～2+，尿蛋白531 mg/24 h，肌酐72 μmol/L，體液免疫IgA 4.26 g/L、IgG 16.71 g/L、IgM 2.40 g/L，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶11.7 U/L，尿量2.6 L/24 h，尿素150.8 mmol/24 h，尿鈉72.0 mmol/24 h，尿氯71.5 mmol/24 h，無機磷7.80 mmol/24 h；抗核抗體(±)、核顆粒型1 ∶100(+)，其余臨床實驗室檢查均陰性；伴皮膚斑丘疹，未見聽力、眼等腎外異常；影像學(xué)檢查、骨骼系統(tǒng)及神經(jīng)發(fā)育未見異常；其兄有慢性腎衰竭史，否認父母有腎病史。經(jīng)ACEI類藥物及中藥方劑治療后，隨訪時尿蛋白波動，最低286 mg/24 h，血肌酐78 μmol/L。

2.2 病理檢查例1：腎臟穿刺組織19個腎小球，其中2個球性硬化，4個節(jié)段性硬化，2個球囊黏連，未見新月體或壞死，輕度系膜增生(系膜基質(zhì)增多及系膜細胞增生)。腎小管輕度萎縮，間質(zhì)纖維化及單個核細胞浸潤占腎皮質(zhì)5%～10%。腎小球小動脈未見明顯異常，個別小葉間動脈輕度內(nèi)膜纖維化。免疫熒光：IgA及C3系膜區(qū)(3+)，IgG、IgM、C1q、Fibrinogen、Kappa、Lambda均陰性。電鏡：系膜擴張，系膜區(qū)可見較多電子致密物沉積，無明確亞結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮下、上皮下及基膜內(nèi)未見電子致密物，足細胞節(jié)段性足突融合；基膜質(zhì)地正常、平均厚度為(263±48) nm。腎小管上皮病變不明顯。例2：腎臟穿刺組織21個腎小球，其中1個球性硬化，2個節(jié)段性硬化(圖1、2)，未見新月體或壞死，5個節(jié)段性輕度系膜增生(系膜基質(zhì)增多)(圖3、4)，其余腎小球未見明顯異常。腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化不明顯，散在少量單個核細胞浸潤。腎小球小動脈及小葉間動脈未見明顯異常。免疫熒光：IgA(2+)、C3(+～2+)，位于系膜區(qū)及節(jié)段性副系膜區(qū)，其余均陰性(圖5、6)。電鏡：節(jié)段性系膜增生，系膜區(qū)見電子致密物沉積，內(nèi)皮下、上皮下及基膜內(nèi)未見電子致密物，足細胞節(jié)段性足突融合；基膜平均厚度為(236±2) nm，偶見節(jié)段性分層(圖7～9)。腎小管病變不明顯。2例腎臟穿刺組織免疫組化標記FN于腎間質(zhì)中等強度陽性，腎小球及腎小管上皮細胞陰性(圖10)。

圖1 PAS染色示腎小球局灶節(jié)段性硬化，腎小管未見萎縮及腎間質(zhì)纖維化，間質(zhì)散在少量單個核細胞浸潤 圖2 PASM染色示腎小球局灶節(jié)段性硬化，基膜淡染 圖3 PAS染色示腎小球毛細血管襻結(jié)構(gòu)完整，系膜輕度節(jié)段性增生 圖4 PASM染色示腎小球毛細血管襻結(jié)構(gòu)完整，系膜輕度節(jié)段性增生，基膜淡染 圖5 腎小球免疫熒光IgA系膜區(qū)及節(jié)段性旁系膜區(qū)陽性，團塊及顆粒狀 圖6 腎小球免疫熒光C3系膜區(qū)陽性，弱于IgA陽性強度 圖7 電鏡低倍鏡下腎小球節(jié)段性輕度系膜增生，足突節(jié)段性融合，基膜薄 圖8 系膜區(qū)可見電子致密物，未見亞結(jié)構(gòu) 圖9 腎小球基膜均質(zhì)變薄 圖10 免疫組化染色FN蛋白在腎小球及腎小管內(nèi)陰性，鮑曼囊及腎間質(zhì)中等陽性，EnVision法

2.3 基因變異特點6例樣本中2例存在FN1(NM212482.1)：c.3289G>A(p.Glu1097Lys)、FN1(NM212482.1)：c.4616C>G(p.Ser1539Cys)變異，其余樣本未檢測出FN1基因變異。FN1 21號外顯子錯義突變致編碼蛋白1 097位谷氨酸替代為賴氨酸，29號外顯子錯義突變致編碼蛋白1 539位絲氨酸替代為半胱氨酸。依據(jù)數(shù)據(jù)庫頻率信息及各分析平臺預(yù)測結(jié)果，且依據(jù)ACMG指南均判斷為可能有害變異。

例1還存在NUP160(NM015231.1)：c.160G>A(p.Glu54Lys)變異，1號外顯子錯義突變導(dǎo)致編碼蛋白54位谷氨酸替代為賴氨酸，依據(jù)數(shù)據(jù)庫頻率信息及各分析平臺預(yù)測結(jié)果，ClinVar未查到該變異的致病信息，且依據(jù)ACMG指南判斷為意義未明變異。例2還存在ITGA3(NM002204.2)：c.3046-4G>A變異，依據(jù)數(shù)據(jù)庫頻率信息，功能軟件DANN評分0.918，dbscSNV評分0.032，且依據(jù)ACMG指南判斷為意義未明變異(表1，圖11)。

表1 FN1、NUP160、ITGA3基因變異

圖11 Sanger測序峰圖：A.FN1 c.3289G>A；B.FN1c.4616C>G；C.NUP160c.160G>A；D.ITGA3c.3046-4G>A

2.4 氨基酸鏈空間結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域、功能預(yù)測FN1：c.3289G>A(p.Glu1097Lys)，變異位點對應(yīng)FN1蛋白第6位的FNⅢ型結(jié)構(gòu)域，臨近肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域位點；FN1：c.4616C>G(p.Ser1539Cys)變異位點對應(yīng)FN1蛋白第10位的FNⅢ型結(jié)構(gòu)域，位于整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域位點，參與細胞間的黏附功能(圖12A)。從氨基酸空間結(jié)構(gòu)來看，與既往已報道的明確致病、可能致病、良性非致病的空間位置明顯不同(圖12B、C)。從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，F(xiàn)N1與ITGA3蛋白存在緊密相關(guān)的作用，而NUP160相對獨立，推測伴薄基膜改變的IgA腎病受參與基膜結(jié)構(gòu)FN1、ITGA3和足細胞NUP160兩條不同的通路影響(圖12D)。

圖12 A.采用IBS.Biocuckoo軟件作圖構(gòu)建FN1蛋白結(jié)構(gòu)域分布圖；B、C.FN1變異位點在氨基酸鏈空間結(jié)構(gòu)：SwissModel數(shù)據(jù)庫顯示FN1兩個變異位點對應(yīng)的編碼氨基酸位點(粉色)Glu1097及Ser1539在氨基酸鏈空間結(jié)構(gòu)分布不同于數(shù)據(jù)庫中既往報道過的致病性、可能致病性(紅色)及良性非致病性(綠色)位點；D.String數(shù)據(jù)庫顯示FN1、ITGA3、NUP160蛋白相互作用關(guān)系：FN1與ITGA3存在密切相互作用，NUP160與這兩個蛋白不存在相互作用

3 討論

FN1基因位于染色體2q35，含46個外顯子，編碼纖連蛋白2 477個氨基酸，是多功能糖蛋白，分血漿型和細胞型，可連接細胞外基質(zhì)與細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架并與調(diào)節(jié)特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的細胞表面異二聚體整合素家族中的多個成員作用，也可結(jié)合其它細胞外基質(zhì)糖蛋白、膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖。功能性纖連蛋白由羧基末端二硫鍵相連的兩個220～250 kDa亞基構(gòu)成二聚體，每個單體由三種不同的同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成，稱為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。細胞型纖連蛋白以多聚體形式裝配成絲狀纖維而存在于細胞外基質(zhì)的疏松結(jié)締組織、基膜和細胞表面，其多種功能的實現(xiàn)依賴于前體mRNA復(fù)雜的時序和細胞種類特異性選擇性剪切，尤其是在Ⅲ型結(jié)構(gòu)域。

既往對腎小球基膜中是否存在FN1蛋白意見不一，近年蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)鑒定了更多參與細胞外基質(zhì)及基膜的成分[10-11]，F(xiàn)N1也被包括在內(nèi)，這在鼠及人類中均得以證明。腎小球基膜發(fā)育成熟存在層級裝配程序，膠原Ⅳα345構(gòu)成基膜的主要支架，laminin 521和足細胞及內(nèi)皮細胞表面受體Integrinα3β1和蛋白聚糖α-dystroglycan結(jié)合，聯(lián)系細胞間相互作用。腎小球基膜的發(fā)育成熟需要足細胞和內(nèi)皮細胞共同作用，而FN1對內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)的定位及功能起重要作用[12-13]。

迄今為止，F(xiàn)N1在腎小球基膜中的作用機制尚未見詳細報道，已知的FN1基因變異導(dǎo)致纖連蛋白腎小球病[14]，本組病例的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)形態(tài)不同于纖連蛋白腎小球病，而且均具有皮疹，這是在FN1變異疾病的臨床表現(xiàn)方面首次被提及，提示FN1：c.3289G>A及c.4616C>G變異在伴薄基膜改變的IgA腎病的腎外表現(xiàn)方面要關(guān)注皮膚病變。有研究提示纖連蛋白腎小球病中主要為血漿型pFN，所報道的基因變異位點多數(shù)位于肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，少數(shù)位于整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本組病例為伴薄基膜改變的IgA腎病，推測可能和變異所影響的氨基酸鏈空間結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，此變異位點影響更多的可能是細胞型cFN。此外，Kliewe等[15]發(fā)現(xiàn)FN1參與足細胞對機械應(yīng)力的感受及調(diào)節(jié)，涉及ITGA3、ITGB1等整合素及黏著斑蛋白。既往也有一篇關(guān)于FN1基因變異致薄基膜病的家系驗證性報道[16]，也有學(xué)者利用生物信息學(xué)分析技術(shù)篩選到IgA腎病中包括FN1在內(nèi)的關(guān)鍵基因[17]。因此，F(xiàn)N1在纖連蛋白腎小球病、足細胞病、糖尿病等代謝性腎病、伴薄基膜改變的IgA腎病中存在不同的作用機制。

有報道稱ITGA3變異引起基膜及足細胞改變而致蛋白尿[18]。本組例2的ITGA3：c.3046-4G>A變異雖然在剪切功能預(yù)測軟件中注釋為可能并不被影響，但鑒于ITGA3對腎小球基膜的形成及足細胞的黏附作用與FN1密切相關(guān)，如有可能仍需進一步行功能學(xué)實驗加以驗證。多種核孔復(fù)合體基因變異與激素抵抗型蛋白尿的發(fā)生有關(guān)。NUP160參與組成核孔復(fù)合體Y型結(jié)構(gòu)，起支撐作用，此基因變異會影響環(huán)內(nèi)部其它構(gòu)成蛋白間結(jié)合穩(wěn)定性從而改變核孔復(fù)合體結(jié)構(gòu)和細胞核形態(tài)，而NUPs致蛋白尿發(fā)生的機制還在探索中，有報道顯示NUP160也可影響足細胞中細胞骨架調(diào)節(jié)成分CdC42的活性[19]。Wang等[20]報道敲低NUP160促進足細胞凋亡、自噬，Nephrin、Podocin和CD2AP表達降低，推測敲低NUP160可促進足細胞遷移，影響細胞骨架及與基膜的黏附。本組例1早期即表現(xiàn)為輕中度蛋白尿，推測除FN1基因外，NUP160基因變異可能也具有協(xié)同作用。

本實驗首次發(fā)現(xiàn)伴薄基膜改變的IgA腎病中存在FN1基因的可能致病性變異，同時推測NUP160、ITGA3基因變異具有引起此類疾病蛋白尿發(fā)生的協(xié)同作用，為臨床FN1基因變異所致疾病表型譜增加了伴皮膚病變及薄基膜改變的IgA腎病這一新的類型，也提示伴薄基膜改變的IgA腎病中存在非膠原Ⅳ基因變異，為此類患者的臨床管理及基因變異檢測提供依據(jù)。