長期超低溫保存后真鯛精子的質(zhì)量變化

陳亞坤, 劉清華 趙春彥 肖志忠 徐世宏 馬道遠(yuǎn) 李 軍

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100039)

長期超低溫保存后真鯛精子的質(zhì)量變化

陳亞坤1,2, 劉清華1, 趙春彥1, 肖志忠1, 徐世宏1, 馬道遠(yuǎn)1, 李 軍1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100039)

通過對精子運(yùn)動率、受精率和超微結(jié)構(gòu)的觀察, 研究了 2003～2009年分 5批冷凍保存的真鯛(Pagrus major)精子經(jīng)1～73個月保存后質(zhì)量變化情況。冷凍精子在40 ℃水浴中解凍, 大約100～110 s轉(zhuǎn)化為液態(tài)后取出, 用海水激活后觀察精子運(yùn)動率, 人工受精 6～8 h后觀察受精率, 同時精子用 2.5%戊二醛前固定, 經(jīng)處理后用掃描電鏡和透射電鏡觀察精子超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明, 冷凍精子的最高運(yùn)動率(87.67%±2.52%)和受精率(71.33%±8.84%)都是2009年保存1個月的精子, 保存1, 13, 26個月的精子運(yùn)動率和受精率差異不顯著(P＜0.05), 保存48個月后的精子運(yùn)動率和受精率顯著低于保存1個月的精子(P＜0.05), 2003年保存的精子(73個月)運(yùn)動率(50.67%±5.31%)和受精率最低(39.56%±0.69%)。精子的超微結(jié)構(gòu)損傷主要包括精子頭部損傷, 線粒體損傷以及精子質(zhì)膜的損傷。

低溫保存; 真鯛 (Pagrus major); 精子; 運(yùn)動率; 受精率

超低溫保存技術(shù)是種質(zhì)細(xì)胞長期保存的重要方法。魚類精子超低溫保存技術(shù)以及精子庫的建立, 對于魚類種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳改良以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要應(yīng)用價值和理論意義。自從 1953年 Blaxter[1]成功冷凍保存大西洋鯡魚(Clupea harengus)精巢以來, 魚類種質(zhì)細(xì)胞的低溫保存研究迅速開展。在過去的50多年中, 世界許多國家的科研工作者圍繞超低溫保存技術(shù)、冷凍損傷機(jī)理及凍精質(zhì)量檢測等方面開展了大量研究工作, 現(xiàn)已建立200多種魚精液的超低溫保存技術(shù), 有些魚種精液已應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究[2]。

目前, 理論上普遍認(rèn)為精子新陳代謝在低溫狀態(tài)下極其緩慢, 在液氮中甚至基本是停止的, 保存時間不會影響精子的運(yùn)動率, 精子的生育力在液氮中能保存200～32 000 a[3]。以前的精子超低溫保存研究主要集中在短期保存, 樣品大多數(shù)在液氮中冷凍保存幾小時到幾周, 最長一般不超過 2 a, 并且認(rèn)為精子在長期保存過程中質(zhì)量不會有所變化[4～6]。然而,隨著超低溫保存技術(shù)和精子質(zhì)量檢測手段的不斷發(fā)展完善, 長期冷凍保存后精子質(zhì)量發(fā)生變化的現(xiàn)象也出現(xiàn)零星報道。鯉魚(Cyprinus carpio)精子的受精率在超低溫保存342 d后顯著低于保存14 d的受精率[7]; 鯰魚(Clarias gariepinus)精子超低溫保存14 d后孵化率為51%, 16個月后下降為41%[8], 類似現(xiàn)象在對蝦和人類精子超低溫保存中也有報道[9～11]。

本實(shí)驗(yàn)室在真鯛(Pagrus major)精液超低溫保存過程中發(fā)現(xiàn), 保存時間對凍精質(zhì)量變化情況存在一定的影響, 并且 15%～18%的二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, 簡稱DMSO)對真鯛精子的保存效果較好[12]。因此, 本實(shí)驗(yàn)對 2003～2009年用 15%DMSO作為抗凍劑保存1～73個月的真鯛精子進(jìn)行檢測, 通過對運(yùn)動率和受精率的觀察, 研究了真鯛精子經(jīng)過不同超低溫保存時間后質(zhì)量的變化情況, 并通過超微結(jié)構(gòu)觀察檢測了精子的損傷情況。

1 材料和方法

1.1 親魚培養(yǎng)及配子采集

親魚(4雌, 6雄; 3～4 kg, 每年 10尾, 9～10齡 )暫養(yǎng)于青島中國科學(xué)院海洋研究所水族樓的方形水泥池中(長×寬×高： 3 m×2.5 m×2 m), 養(yǎng)殖水體溫度為16～18℃。每年3月中旬至5月下旬, 處于真鯛生殖盛期, 采用人工擠壓腹部的方法采集精液。操作前首先將雄魚置于 0.003%的丁香酚溶液中 3～5min至完全麻醉, 將魚體洗凈擦干, 輕輕擠壓腹部采集精液于器皿中, 操作過程中盡量避免海水、糞便、尿液等的污染。在 2003、2005、2007、2008和 2009年分別采集 5批精子進(jìn)行超低溫冷凍保存。為避免不同批次精子的差異, 僅運(yùn)動率高于 90%的精子用于實(shí)驗(yàn)。精子的運(yùn)動率是用自然海水以 1∶1000的比例進(jìn)行稀釋激活精子, 在 100倍顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動情況, 計數(shù)100個精子中運(yùn)動精子的個數(shù), 運(yùn)動精子個數(shù)與總計數(shù)精子個數(shù)的比例為精子的運(yùn)動率。人工受精實(shí)驗(yàn)所用卵子取自一條雌魚(質(zhì)量好的卵占總卵比例高于95%的卵子用于實(shí)驗(yàn))。質(zhì)量好的卵呈規(guī)則圓形, 顏色為半透明的微黃色。

1.2 藥品及儀器

DMSO購自SIGMA公司, 其他藥品均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。抗凍劑稀釋液由 Hanks緩沖液配制(8 g/L NaCl, 0.4 g/ L KCl, 0.14 g/ L CaCl2,0.1 g/ L MgSO4·7H2O, 0.1 g/ L MgCl2·6H2O, 0.06 g/ L Na2HPO4·12H2O, 0.06 g/ L KH2PO4, 1g/ L 葡萄糖,0.35 g/ L NaHCO3)。程序降溫儀型號Kryo-360-1.7;光學(xué)顯微鏡型號 Nikon-YS-100; 液氮罐型號YDS-30B-80。

1.3 真鯛精子的冷凍保存

精液與 15%DMSO按 1∶3的體積比均勻混合,將混合液(共1.6 mL)置于2 mL的冷存管后轉(zhuǎn)入程序降溫儀, 按照預(yù)設(shè)程序進(jìn)行冷凍處理。冷凍程序?yàn)椋?0℃平衡 5 min, 然后以-20 ℃/min的速度從 0℃ 降到-150℃, 快速從程序降溫儀腔體內(nèi)取出樣品投入到盛有液氮的液氮罐中保存。每一管樣品為一個平行樣, 每次實(shí)驗(yàn)至少3個平行樣, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 真鯛精子長期超低溫保存后運(yùn)動率觀察和受精實(shí)驗(yàn)

對2003～2009年分5批保存1～73個月的精子進(jìn)行水浴解凍, 水浴溫度為40 ℃。冷凍樣品在水浴中大約100～110 s,轉(zhuǎn)化為液態(tài)后取出。解凍的精子用自然海水以1∶250的比例進(jìn)行稀釋激活, 然后顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動率。受精實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[12], 精子與卵的個數(shù)比例按500∶1真鯛標(biāo)準(zhǔn)化精卵比進(jìn)行人工受精實(shí)驗(yàn), 對解凍精子進(jìn)行人工受精, 受精后 6～8 h, 胚胎發(fā)育到囊胚期時計算受精率, 受精率為發(fā)育到囊胚期的胚胎數(shù)占最初卵總數(shù)的百分比(受精率＝囊胚期胚胎數(shù)/卵總數(shù))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 真鯛精子超低溫保存后超微結(jié)構(gòu)變化

鮮精和15%DMSO冷凍保存的凍精用2.5%戊二醛(0.2 mol/L, pH=7.4,磷酸緩沖液配制)進(jìn)行前固定。掃描電鏡(scanning electron microscope, 簡稱 SEM)樣品, 經(jīng)磷酸緩沖液(0.2 mol/L, pH=7.4)漂洗后, 用1%鋨酸后固定, 然后經(jīng)酒精系列脫水, 醋酸異戊脂置換, 離子鍍膜等步驟后, 掃描電鏡(KYKY-1000B)下觀察、拍照。透射電鏡(transmission electron microscopy, 簡稱TEM)樣品, 按常規(guī)步驟進(jìn)行預(yù)包埋、切塊后, 用 1%鋨酸固定, 梯度酒精脫水, 然后Epon812滲透包埋, 超薄切片, 經(jīng)鈾鉛雙重染色后,透射電鏡(日立H-7000)下觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析(SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SD表示, 均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA分析法, 差異顯著性分析采用 SNK(Student-Newman-Keuls’test)法。

2 結(jié)果

2.1 冷凍精子的運(yùn)動率和受精率

2003～2009年分5批冷凍保存的精子, 經(jīng)過不同時間的超低溫冷凍保存后其運(yùn)動率和受精率參見表1。

表1 冷凍精子的運(yùn)動率和受精率Tab.1 Motility and fertilization rate of post-thaw sperm

經(jīng)過長期超低溫冷凍保存后, 冷凍精子的運(yùn)動率和受精率隨保存時間的不同而存在顯著變化。冷凍精子的最高運(yùn)動率和受精率都是2009年保存1個月的精子, 保存1, 13, 26個月的精子運(yùn)動率和受精率差異不顯著(P＞0.05), 保存 48個月后的精子運(yùn)動率和受精率顯著低于保存 1, 13, 26個月的精子(P＜0.05), 2003年保存的精子(73個月) 運(yùn)動率和受精率最低。

2.2 真鯛精子超低溫保存后超微結(jié)構(gòu)變化情況

鮮精和經(jīng)超低溫保存后冷凍精子的超微結(jié)構(gòu)如圖1和圖2。

圖1 鮮精和冷凍精子掃描電鏡照片(標(biāo)尺為5μm)Fig. 1 The SEM photos of fresh and post-thaw sperm1-1.鮮精; 1-2.頭部破裂的精子; 1-3.線粒體脫落的精子; 1-4.膜損傷精子1-1. fresh sperm; 1-2. sperm with broken head; 1-3. sperm with mitochondria flaking off; 1-4. sperm with membrane damage

圖2 鮮精和冷凍精子透射電鏡照片(標(biāo)尺為1 μm)Fig. 2 TEM photographs of fresh and post-thaw sperm2-1．鮮精, nu： 細(xì)胞核; ne： 核膜; mi： 線粒體; pm： 質(zhì)膜; 2-2.精子核膜, 質(zhì)膜消失, 線粒體正在溶解;2-3.線粒體消失的精子; 2-4.精子核膜消失, 質(zhì)膜斷裂2-1. fresh sperm, nu： nucleus; ne： nuclear envelope; mi： mitochondrion; pm： plasmalemma; 2-2. sperm with nuclear envelope and plasmalemma loss and mitochondria in the process of dissolving; 2-3. sperm with mitochondrial loss; 2-4. sperm with disappeared nuclear envelope and broken plasmalemma

正常真鯛精子呈近似圓球形, 直徑為 1.3～1.4 μm,包括頭部, 中段和尾部 3部分結(jié)構(gòu), 其中頭部和中段緊密相接(圖 1-1和圖 2-1)。經(jīng)過長期超低溫保存后的精子遭受不同程度的損傷, 主要有： 精子頭部損傷(圖 1-2), 精子線粒體損傷(圖 1-3和圖 2-2,2-3),以及精子質(zhì)膜的損傷(圖1-4和圖2-2,2-4)。

3 討論

一般認(rèn)為在液氮(-196 ℃)超低溫條件下, 精子處于休眠狀態(tài), 代謝活動基本停止, 長時間冷凍保存對精液的質(zhì)量沒有顯著影響。在魚類精子超低溫保存研究中, Suquet等[4]報道大菱鲆(Psetta maxima)精液保存9個月后, 凍精的受精率、存活率都與鮮精差異不顯著。冷凍保存 1a的大黃魚(Pseudosiaena crocea)精液受精率、孵化率與鮮精相近[5]。保存1周和 1a的大馬哈魚(Siniperca chuatsi)的冷凍精子,在受精率和孵化率方面與鮮精無顯著差別[6]。然而,本實(shí)驗(yàn)對 2003～2009年保存的精子進(jìn)行檢測, 結(jié)果表明保存時間會明顯影響真鯛精液超低溫保存的效果, 盡管保存1, 13, 26個月后精子運(yùn)動率和受精率沒有顯著差別, 但保存43個月后精子的運(yùn)動率和受精率顯著低于保存1, 13, 26個月的精子。對于其他魚種的研究, Kerby等[13]發(fā)現(xiàn)液氮中保存的條紋鱸魚(Morone saxatilis)精子的受精能力隨著保存時間的延長而降低。在鯉魚精液超低溫保存中也發(fā)現(xiàn), 保存342 d的精子受精率顯著地低于保存14d的精子受精率[7]。同樣保存16個月的鯰魚精子孵化率顯著低于保存14 d的精子孵化率[8]。在人類精子超低溫冷凍保存研究中, Smith等[5]對凍貯的精液作了較長時間的觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在液氮中凍貯超過 36個月后,精子運(yùn)動率顯著降低。從人工受精和臨床實(shí)踐角度看, 尹志康等[11]認(rèn)為人類精液超低溫保存以不超過3a為最適凍貯時間。類似的結(jié)果在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)精子的超低溫保存中也有報道[9], 研究者檢測了超低溫保存30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 d的精子質(zhì)量, 保存 60 d的凍精活力與鮮精無差異, 但是保存90～120 d的凍精活力顯著降低。

迄今, 這種經(jīng)長期冷凍保存后精子質(zhì)量下降的現(xiàn)象在動物種質(zhì)超低溫保存研究中還沒有合理的解釋, 對于植物低溫保存的研究, Walters等[14]提出,低溫并不能完全阻止種子的衰退, 并把種子的退化歸因于活性氧(reactive oxygen species,簡稱ROS)的產(chǎn)生和累積。在動物精子的超低溫保存過程中ROS過量產(chǎn)生也有報道[15]。過量ROS會攻擊細(xì)胞膜,導(dǎo)致膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化, 造成膜的損傷[15～17]。本實(shí)驗(yàn)中通過超微結(jié)構(gòu)觀察檢測到精子的損傷包括頭部破裂, 線粒體和膜損傷, 但膜的損傷是否與 ROS過量產(chǎn)生有關(guān)以及在長期保存過程中ROS是否存在累積,在魚類精子超低溫保存研究中未見報道。

本實(shí)驗(yàn)表明, 長期超低溫保存并不能維持真鯛精子質(zhì)量不變, 經(jīng)過長期冷凍保存后, 精子的運(yùn)動率和受精率隨時間的延長會顯著下降, 因此在建立精子庫進(jìn)行種質(zhì)保存時, 應(yīng)該考慮到精子保存的最佳年限問題, 對精子進(jìn)行定期更新,并且真鯛精子在長期保存過程中質(zhì)量下降的機(jī)理及其是否與ROS有關(guān)有待深入探討研究。

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Quality change of Pagrus major sperm after long-term cryopreservation

CHEN Ya-kun1,2, LIU Qing-hua1, ZHAO Chun-yan1, XIAO Zhi-zhong1,XU Shi-hong1, Ma Dao-yuan1, LI Jun1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Mar., 22, 2010

cryopreservation; Pagrus major; sperm; motility; fertilization rate

After cryopreservation (1-73 months), the quality of Pagrus major sperm, which was cryopreserved from 2003 to 2009 in 5 batches, was examined by observing motility, fertilization rate and ultrastructures. The cryopreserved sperm were thawed in 40oC water bath for 100～110 s. After activation with seawater, the motility of the sperm was estimated; 6-8 h after artificial fertilization, fertilization rate was examined; and after being fixed with by 2.5% glutaraldehyde, the ultrastructure of sperm was studied with scanning electron microscope and transmission electron microscope. The highest motility (87.67%±2.52%) and fertilization rate (71.33%± 8.84%) were obtained in sperm after a 1-month cryopreservation, even though they were not significantly different from those of the sperm after a 13-month or and 26-month cryopreservation (P＞0.05). After a 48-month cryopreservation, the motility and fertilization rate decreased significantly in comparison with those of sperm after a 1-month cryopreservation (P ＜0.05). The lowest motility (50.67% ± 5.31%) and fertilization rate (39.56% ± 0.69%) were obtained in sperm cryopreserved for 73 months; main ultrastructural damage was observed in the head, mitochondria and membranes of sperm.

Q331

A

1000-3096(2010)06-0050-05

2010-03-22;

2010-04-10

中國科學(xué)院海洋研究所知識創(chuàng)新領(lǐng)域前沿項(xiàng)目(Y02507101Q)

陳亞坤(1982-), 女, 吉林德惠人, 碩士研究生, 主要從事低溫生物學(xué)研究, E-mail：yakunchen@163.com; 李軍, 通信作者, 電話： 0532-82898716, E-mail：junli@qdio.ac.cn

(本文編輯： 譚雪靜)