包裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況分析

郭焜鵬，何 娟，張海韻，高 晗，楊 滔，宋 晟

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410000）

1 背景信息

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》于2015年5月24日起正式實(shí)施，標(biāo)準(zhǔn)刪除了菌落總數(shù)、霉菌等項(xiàng)目，保留了大腸菌群檢驗(yàn)項(xiàng)目的同時(shí)，新增了銅綠假單胞菌檢驗(yàn)項(xiàng)目[1]。

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，是一種革蘭染色陰性菌，具有單根鞭毛的細(xì)小桿菌，在土壤、空氣、地表水及污水等中廣泛存在，可通過(guò)水源、土壤、工器具、接觸等多種途徑傳播，是水質(zhì)污染的指示菌，對(duì)化學(xué)藥劑的抵抗力比普通革蘭氏陰性菌強(qiáng)，而且易產(chǎn)生耐藥性。銅綠假單胞菌對(duì)常規(guī)水質(zhì)消殺處理技術(shù)如紫外線、臭氧和二氧化氯等，均有很強(qiáng)的抵抗力，故單純用大腸菌群作為瓶裝水常規(guī)污染指示菌，并不能充分反映水質(zhì)污染程度。《歐盟飲用水水質(zhì)指令》（98/83/EC）也規(guī)定，瓶裝或桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的指標(biāo)值為0個(gè)/250 mL。美國(guó)、加拿大、巴西、日本等均限制瓶裝飲用水（包括天然礦泉水水源）中銅綠假單胞菌的MPN＜3/L或每250 mL中不得檢出[2]。

2 銅綠假單胞菌檢出情況分析

廣東省疾病預(yù)防控制中心2013—2015年在廣東省21個(gè)地級(jí)市及順德區(qū)共檢測(cè)桶裝水樣品1 901份，檢出銅綠假單胞菌陽(yáng)性樣品112份，陽(yáng)性率為5.9%[3]。大理州疾病預(yù)防控制中心2014年至2015年對(duì)大理州內(nèi)各桶裝水品牌的送水銷售站的66份桶裝水進(jìn)行檢測(cè)，銅綠假單胞菌陽(yáng)性檢出率為6.06%[4]。河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測(cè)所2016—2019年抽檢的1 875批次的包裝飲用水中，71批次檢出綠假單胞菌，檢出率為3.78%，432批10 L以上桶裝水中檢出62批，檢出率為14.35%，312批礦泉水中檢出2批，檢出率為0.64%[5]。

本研究對(duì)長(zhǎng)沙、株洲、岳陽(yáng)、邵陽(yáng)、懷化、湘西、永州和張家界等地的桶裝飲用水進(jìn)行三級(jí)采樣，每批次5個(gè)獨(dú)立樣品，依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）進(jìn)行檢測(cè)，量取250 mL水樣用抽濾泵過(guò)濾，濾膜貼于CN培養(yǎng)基上36 ℃培養(yǎng)24～48 h后取疑似陽(yáng)性菌進(jìn)行生理生化鑒定，共收集26株銅綠假單胞菌，并選取18株進(jìn)行生物信息學(xué)分析，即對(duì)純化菌株提取DNA后，基因組測(cè)序，分析相關(guān)基因。

3 銅綠假單胞菌的危害

銅綠假單胞菌有多種毒素因子，主要包括綠膿素、粘附素、肉毒素、彈性蛋白酶、多糖莢膜和磷脂酶C等多種外毒素、內(nèi)毒素等致病因子，是導(dǎo)致急性腸道疾病和皮膚炎癥的食源性致病菌。國(guó)內(nèi)已有因銅綠假單胞菌污染飲用水導(dǎo)致中毒事件發(fā)生的報(bào)告。因其具有天然耐藥能力，在特定條件下，它還可引起繼發(fā)感染或混合感染的慢性炎癥，引發(fā)肺炎、腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重急性感染的報(bào)道也屢見(jiàn)不鮮。

飲用水中的有機(jī)物質(zhì)含量雖然極低，剛出廠時(shí)的桶裝水中銅綠假單胞菌數(shù)量也較少，但包裝水消費(fèi)周期較長(zhǎng)，保質(zhì)期也至少在30 d以上，對(duì)有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物要求較低的銅綠假單胞菌可迅速增殖，達(dá)到104CFU·mL-1。夏季高溫導(dǎo)致包裝飲用水消費(fèi)量最大，而氣溫更是接近于銅綠假單胞菌的最適生長(zhǎng)溫度區(qū)間，所以夏季是人感染銅綠假單胞菌的高峰期。一旦受感染，微生物將在宿主體內(nèi)大量繁殖。

中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)作為一個(gè)權(quán)威的微生物耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在2017年對(duì)全國(guó)29所綜合性醫(yī)院及5所兒童醫(yī)院收集到的16 562株銅綠假單胞菌的耐藥性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)所測(cè)試的環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、哌拉西林、頭孢吡肟和兩種酶抑制劑復(fù)合劑的耐藥率小于20%[6]；在2018年對(duì)全國(guó)44所醫(yī)院收集到的23 431株銅綠假單胞菌對(duì)所測(cè)試的慶大霉素、左氧氟沙星、兩種酶抑制劑復(fù)合制劑、環(huán)丙沙星、哌拉西林和頭孢吡肟的耐藥率均≤21%[7]。

4 銅綠假單胞菌的抗消毒劑、致病性和耐藥性

隨著消毒劑在醫(yī)療衛(wèi)生、生產(chǎn)包裝水行業(yè)中的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌的抗消毒劑的特性也展現(xiàn)出來(lái)。深入研究后發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌存在多種耐消毒劑基因，對(duì)季胺鹽類、雙胍類、酚類、醇類和碘類等都有一定的抗性。目前關(guān)于銅綠假單胞菌耐消毒劑基因研究最多的就是qac基因家族，其可以使銅綠假單胞菌對(duì)季胺類（如苯扎溴銨）、雙胍類（如氯已定）等消毒劑產(chǎn)生抗性[8]。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，研究人員通過(guò)對(duì)眾多銅綠假單胞菌的基因組測(cè)序，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)有數(shù)以百計(jì)的基因編碼毒力相關(guān)因子。經(jīng)研究，部分致病途徑有：①通過(guò)鞭毛及其他如Ⅳ型菌毛等與宿主細(xì)胞或蛋白發(fā)生粘附作用，在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生相應(yīng)致病效應(yīng)；②通過(guò)群體感應(yīng)發(fā)揮致病作用，如調(diào)控毒素基因的表達(dá)以及形成生物膜等[9]。而生物膜又是引起飲用水企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量不達(dá)標(biāo)的關(guān)鍵因素。

魏磊等[10]對(duì)湖北、云南等全國(guó)9個(gè)省36家水廠進(jìn)行采樣，在采集的108個(gè)樣本中分離36株銅綠假單胞菌，以P.aeruginosaATCC 15442為陽(yáng)性對(duì)照，Escherichia coliATCC 25922為陰性對(duì)照，ecfX為對(duì)照基因，分別檢測(cè)exoU、exoS、phzM、toxA和lasB在36株銅綠假單胞菌中的存在情況，毒力基因exoU、exoS、phzM、toxA和lasB在分離到的36株銅綠假單胞菌中的檢出率高，但分離到的菌株對(duì)所選取的14種抗生素均無(wú)耐藥性。

銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜。其主要因素有：①細(xì)菌產(chǎn)生抗菌活性酶，如β-內(nèi)酰胺酶，能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，導(dǎo)致藥物失活；②突變抗菌藥物作用的靶位，如DNA旋轉(zhuǎn)酶等結(jié)構(gòu)發(fā)生靶位改變，從而逃避抗菌藥物；③外膜的微孔蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或數(shù)量減少，使外膜通透性降低，很多藥物將不易進(jìn)入細(xì)菌；④生物膜的形成，作為由胞外多聚物所構(gòu)筑的膜樣結(jié)構(gòu)物理屏障，可以有效延緩或阻止大部分臨床抗菌藥物的滲入菌體；⑤主動(dòng)泵出系統(tǒng)，主要功能是將菌體毒素排出體外[11]。

5 飲用水微生物污染控制

國(guó)內(nèi)桶裝飲用水生產(chǎn)過(guò)程中造成銅綠假單胞菌污染的主要風(fēng)險(xiǎn)有：①生產(chǎn)企業(yè)的水源和源水池的保護(hù)不當(dāng)，使細(xì)菌大量繁殖；②儲(chǔ)水器、水處理相關(guān)設(shè)備、輸水和灌裝線的管材被細(xì)菌污染；③水體消毒殺菌不徹底；④生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中相關(guān)人員管控不到位，操作不規(guī)范；⑤灌裝車間環(huán)境未監(jiān)測(cè)、環(huán)境消殺不到位；⑥設(shè)備老舊、清洗消毒工位人員不足；⑦包材儲(chǔ)存車間環(huán)境不規(guī)范，包材被污染；⑧回收桶消毒不徹底，清潔后堆放不規(guī)范；⑨消毒劑的配制和使用不科學(xué)；⑩缺少出廠檢驗(yàn)和關(guān)鍵點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控[12]。

6 生產(chǎn)過(guò)程控制

①水源監(jiān)測(cè)。企業(yè)要注意對(duì)生產(chǎn)飲用水的水源進(jìn)行保護(hù)，定期監(jiān)測(cè)。②水處理工藝。水處理裝置應(yīng)定期維護(hù)，如更換濾膜和濾料、檢查濾膜性能，確保過(guò)濾及純化裝置的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。③空氣潔凈度。灌裝車間空氣潔凈度應(yīng)滿足《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范》（GB 19304—2018）中的要求，設(shè)置空氣凈化和消毒設(shè)施，空氣清潔度應(yīng)達(dá)到10 000級(jí)，罐裝局部可達(dá)到100級(jí)為宜。④包裝材料。不潔的包裝材料是銅綠假單胞菌的重要傳播媒介。加強(qiáng)回收桶的清潔消毒，尤其是對(duì)其內(nèi)部的清洗[13]。⑤人員管理。人員操作不當(dāng)會(huì)造成二次污染，是引起桶裝飲用水銅綠假單胞菌污染的又一類突出原因。強(qiáng)化操作人員衛(wèi)生意識(shí)，杜絕人為污染[14]。

7 結(jié)語(yǔ)

目前我國(guó)在基因?qū)用嫜芯可婕笆吃葱曰蛩葱糟~綠假單胞菌耐藥性的研究。因此，有必要評(píng)估通過(guò)全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)進(jìn)行初步研究水源性銅綠假單胞菌的相關(guān)特性基因，從而可以分析其耐藥特征及變化趨勢(shì)，并通過(guò)監(jiān)測(cè)飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況，為后期溯源性分析提供數(shù)據(jù)支撐，從而保障廣大消費(fèi)群體的飲水安全。