張 黎,譚 凡,鄭龍龍
山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,太谷 030801
豬鏈球菌(Streptococcus suis)廣泛存在于自然界,是生豬生產(chǎn)過程中極易發(fā)生的傳染病,嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。病豬常出現(xiàn)腦膜炎、急性敗血癥等癥狀,嚴(yán)重影響豬的健康生長,給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年來,豬鏈球菌病在國內(nèi)某些地區(qū)暴發(fā)流行,傳播速度快、發(fā)病率和死亡率高,大多數(shù)呈垂直和水平傳播[1]。根據(jù)S.suis菌體莢膜抗原特性分為不同的血清型,其中以豬鏈球菌血清2型(Streptococcus suisserotype 2,SS2)流行最廣,對豬的致病性最強(qiáng)[2]。特別是敗血型S.suis是山西省SS2 中危害最為嚴(yán)重的菌株[3-4],青年豬發(fā)病突然,病程短、死亡率高,且與非洲豬瘟臨床癥狀相似,對養(yǎng)殖戶造成巨大的恐慌和經(jīng)濟(jì)危害。
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)基因是SS2 高度保守的毒力基因,能與感染致病性SS2 的豬陽性血清反應(yīng);同時(shí),基因特異性高,能夠與其他血清型區(qū)分,因此GDH 常作為SS2 GDH 診斷抗原用于S.suis血清型的鑒別[5-7]。敗血型S.suis發(fā)病急,且臨床和死亡癥狀與非洲豬瘟有一定的相似,現(xiàn)場剖檢取組織散毒的風(fēng)險(xiǎn)較大。發(fā)生敗血癥時(shí)血液中常含有大量的致病菌,是分離致病菌的良好材料。因此,本研究使用抗凝管無菌取尾根血和耳靜脈血并混合,進(jìn)行病原診斷和藥敏試驗(yàn),為該病的臨床診療提供新思路和用藥參考。
50 日齡12~15 kg 仔豬(n=10)于早晨巡欄時(shí)未見任何異常癥狀,飼喂0.5~1.0 h 后陸續(xù)出現(xiàn)角弓反張、嘶叫、全身顫抖或頸部僵直,偏頭或呈一個方向打轉(zhuǎn)劃等臨床癥狀。眼結(jié)膜充血,流淚有少量膿性分泌物,有漿液性鼻汁,使用鎮(zhèn)靜劑氯丙嗪和高糖靜脈注射及肌肉注射磺胺嘧啶鈉、恩諾沙星3 d后,4 頭仔豬于發(fā)病第3~5 天逐漸開始恢復(fù),但仍有行動障礙,2 頭仔豬不能站立;4 頭仔豬死亡(發(fā)病第1 天死亡2 頭,第2 天和第3 天各死亡1 頭)。發(fā)病豬未用藥時(shí)使用抗凝管取尾根血和耳靜脈血各100~200 μL 并混合,4 ℃保存送檢。樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、PCR 分型鑒定和藥敏試驗(yàn)。EasyTap 聚合酶(北京全式金);DL1 000 Marker(Biomed),其他化學(xué)試劑均從Sigma-Aldrich 公司購買。
1)SS2 分離培養(yǎng)。每100 μL 抗凝血加入200 μL 綿羊血液體培養(yǎng)基,37 ℃ 50 r/min 振蕩4 h,取100 μL 增菌液涂布于綿羊血固體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,觀察菌落周圍形成的溶血環(huán)。
2)SS2 革蘭氏染色。取形成溶血環(huán)的SS2 疑似菌落,參考杭州微生物試劑有限公司革蘭氏染色液操作說明,進(jìn)行革蘭氏染色。
3)SS2 總DNA 提取和PCR 鑒定。刮取上述鑒定過的SS2 疑似菌落,每個樣品取5 個菌落,加50 μL 溶菌酶溶液靜置5 min,沸水裂解5 min;4 ℃靜置10 min 后作為模板進(jìn)行PCR 檢測,測定SS2GDH基因。根據(jù)Kutz 等[8]建立的SS2GDH基因(Genbank:AF229683),設(shè)計(jì)產(chǎn)物長度為439 bp的特異性引物。GDH-F:5’-CCTTGGTCATGCAC CAAACC-3’,GDH-R:5’-CCTGTTTTTGAAGCAC ACCCAG-3’,生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件為:55 ℃退火20 s,30 個循環(huán),最后再72 ℃延伸5 min。
4)藥敏試驗(yàn)。刮取5 個經(jīng)本文“1.2.2)、1.2.3)”初步鑒定的SS2 分離菌株至1 mL 營養(yǎng)肉湯振蕩混勻后,按常規(guī)細(xì)菌接種方法取菌液100 μL 均勻涂抹在MH 藥敏培養(yǎng)基上,并貼上標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片(直徑6 mm),37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。
6 份樣品在綿羊血固體培養(yǎng)基上均有不同透明程度的β 溶血環(huán),其中4 份陸續(xù)死亡的豬全血樣品引起的溶血更為明顯。疑似菌落呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落。
形成溶血環(huán)的疑似菌落經(jīng)革蘭氏染色,菌體呈革蘭氏陽性,卵圓形菌體7~10 個呈短鏈狀排列;少數(shù)菌落的菌體15~20 個排成長鏈。
SS2GDH基因檢測結(jié)果顯示,5 例發(fā)病豬(用藥治療后死亡的4 頭豬、1 頭豬不能站立)呈陽性,SS2 陽性率占S.suis分離株的83.3%(5/6)。
5 例SS2 分離株對恩諾沙星、大觀霉素、頭孢曲松鈉中度敏感(抑菌圈直徑分別為14、12、12 mm),對慶大霉素、丁胺卡那霉素、替米考星、鏈霉素、阿莫西林均耐藥(抑菌圈直徑均為6 mm)。
本文采用全血對疑似S.suis感染引起的敗血癥發(fā)病豬進(jìn)行SS2 分離鑒定,并經(jīng)PCR 鑒定GDH毒力基因獲得5 株SS2,感染率為50%(5/10)。SS2分離株對恩諾沙星、大觀霉素、頭孢曲松鈉中度敏感,建議在飼料中添加恩諾沙星+林可大觀霉素進(jìn)行針對性預(yù)防,發(fā)病豬肌肉注射頭孢曲松鈉和氯丙嗪等藥物針對性治療。
S.suis對惡劣環(huán)境耐受型較強(qiáng),污染養(yǎng)殖區(qū)后很難徹底清除,極易造成水平傳播,并不斷向場外擴(kuò)散。S.suis不僅病豬攜帶,健康豬攜帶率也高,而且存在多重耐藥和致病性強(qiáng)的菌株[9]。國內(nèi)研究者報(bào)道,采集江西省疑似S.suis感染病死豬的肺臟和關(guān)節(jié)液進(jìn)行耐藥基因檢測,分離株攜帶四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類以及磺胺類、氟喹諾酮類耐藥基因[10]。近期國內(nèi)已報(bào)道多起因SS2 引起的豬群發(fā)病死亡[11-13],藥物防控效果不理想。從事生豬養(yǎng)殖與屠宰相關(guān)行業(yè)人員時(shí)有SS2感染[14],該病需要人獸共治,加強(qiáng)從業(yè)者的重視。我國已研制出商品化的豬鏈球菌多價(jià)滅活菌、亞單位疫苗,采用疫苗進(jìn)行免疫接種能明顯降低SS2 引起的敗血性死亡,對該病的預(yù)防和控制有重要意義。