Drp1 異構(gòu)體在線粒體分裂和細胞死亡中的作用

劉喆豪，李京睿，謝樹春，于明明，黃家誠，丁冶春，范小娜?

（1.贛南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.贛南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

線粒體在能量代謝和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的細胞功能中發(fā)揮重要作用［1］。 線粒體細胞器的形態(tài)因細胞種類和不同條件而具有很大的差異［2］，它主要通過融合和分裂等形成動態(tài)變化。 動力相關(guān)蛋白是GTP 酶家族蛋白，包括具有融合活性的Mfn1、Mfn2和Opa1 以及具有分裂活性的Drp1，他們共同調(diào)控線粒體的動力學(xué)［3］。 在這些 GTP 酶家族蛋白中，Drp1 常與各種病理性變化和細胞死亡具有高度相關(guān)性。 Drp1 是 Shin 等人（1997）首次在人肝癌HepG2 細胞中發(fā)現(xiàn)的［4］。 Drp1 在人類細胞中具有廣泛表達，是線粒體分裂的主要調(diào)節(jié)因子。 因此，Drp1 在調(diào)控細胞分化、代謝、增殖及死亡等各種級聯(lián)信號中發(fā)揮重要作用［5］。

在酵母、秀麗隱桿線蟲、果蠅和嚙齒動物中均發(fā)現(xiàn)有Drp1 同源物，它們具有高度的序列相似性。人類Drp1 基因的選擇性剪接已有報道，但其病理生理學(xué)意義研究較少。 大多數(shù)基因剪接后異構(gòu)體具有與蛋白質(zhì)相互作用的特異性，這可能意味著不同的異構(gòu)體在不同組織具有特殊的功能，特別是如果它們表達豐富時，其產(chǎn)生的生理學(xué)作用就更為顯著［6］。 有研究表明，Drp1 異構(gòu)體可能在細胞死亡中具有重要作用［7］。 在此，本文將對Drp1各種異構(gòu)體在線粒體分裂和細胞死亡中的作用進行簡要綜述。

一、人類Drp1 異構(gòu)體

人類Drp1 蛋白由DNM1L 基因編碼，該基因包含21 個外顯子，位于12 號染色體上。 在其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上，通常存在三個位點可進行選擇性剪接。 一個位于 GTPase 結(jié)構(gòu)域，另外兩個具有可變結(jié)構(gòu)域［8］494，總共可產(chǎn)生九種異構(gòu)體，本文對該因子命名系統(tǒng)進行重新整理。 除非有特別說明，將使用異構(gòu)體1 的氨基酸編號以及異構(gòu)體6 的外顯子編號。

絕大多數(shù)研究對Drp1 的四個結(jié)構(gòu)域均使用經(jīng)典的命名系統(tǒng)，即GTPase 結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域、可變結(jié)構(gòu)域和 GTPase 效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域［9］（圖 1A）。Drp1 蛋白結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，它們均具有原型的動力蛋白折疊，具有三個不同的（非連續(xù)的）結(jié)構(gòu)域，即GTPase 結(jié)構(gòu)域，束信號元件（BSE）以及莖部區(qū)域［10］。 而第四個結(jié)構(gòu)域為可變結(jié)構(gòu)域。 中間結(jié)構(gòu)域和GTPase 效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域形成莖部區(qū)域。 另外，部分 GTPase 結(jié)構(gòu)域和部分 GTPase 效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域可構(gòu)成三個 BSE 基序［10］。 在一些異構(gòu)體中，GTPase 結(jié)構(gòu)域包含13 個氨基酸插入，稱之為A?插入子。 而可變結(jié)構(gòu)域包含37 個氨基酸的插入，則稱為B?插入子（圖1A）。

圖1 Drp1 異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)及編碼區(qū)域圖

DNM1L 轉(zhuǎn)錄體的選擇性剪接主要涉及外顯子3（編碼GTPase 結(jié)構(gòu)域中的A?插入子）和外顯子16 和17（編碼可變結(jié)構(gòu)域中的 B?插入子）（圖1B）。 含有外顯子3 的Drp1 異構(gòu)體主要表達于神經(jīng)細胞類型，包括皮層，海馬和小腦神經(jīng)元。 這些結(jié)果表明，包含外顯子3 的Drp1 異構(gòu)體，如異構(gòu)體6、8 和9，可能在神經(jīng)元中具有偏好性表達。 對于外顯子16 和17，只存在于異構(gòu)體1、6 和7，具有完整的B?插入（圖1B）。 目前已有報道，異構(gòu)體1 和6 在神經(jīng)元中高度表達［11］。

值得注意的是，在異構(gòu)體7 中，5’非翻譯區(qū)同時存在于外顯子1 和2 中，并在外顯子2 而非外顯子1 中的交替起始密碼子處啟動翻譯，同時缺少4個連續(xù)的外顯子（外顯子 5?8）（圖 1B）。 此外，三個保守的 GTP 結(jié)合基序（GTQSSGK 由外顯子1?2編碼，DLPG 由外顯子 6 編碼，TKLD 由外顯子 8 編碼）和一個Dynamin 特異性的G 帽基序（由外顯子8?9 編碼的 GVVNRSQ）不存在于異構(gòu)體 7 中。 然而，這些基序?qū)TP 的結(jié)合是必不可少的。

（一）A?插入子和 B?插入子

A?插入子是Drp1 的GTPase 結(jié)構(gòu)域中插入的13 個氨基酸，主要存在于異構(gòu)體 6、8 和 9。 B?插入則是可變結(jié)構(gòu)域中的一個37 個氨基酸區(qū)域，常見于異構(gòu)體 1、6 和 7（圖 1B）。 在異構(gòu)體 3 和 9 并沒有這些氨基酸插入。 Macdonald 等人（2016）對只有A 插入子（相當于異構(gòu)體9）或B 插入子（相當于異構(gòu)體1）、大鼠 Drp1 異構(gòu)體 1 同時含有 A?和B?插入子（相當于人類Drp1 異構(gòu)體6）、人類Drp1異構(gòu)體3 同時缺少A?和B?插入子等進行研究。 在結(jié)構(gòu)上，相比于那些含有B?插入子的脂質(zhì)體，缺少B?插入子的脂質(zhì)體可形成直徑較大的螺旋狀聚合物（＞100nm）。 在功能上，當兩種插入子均不存在時，GTPase 基礎(chǔ)表達活性和心磷脂刺激的GTPase表達活性均為最高，而兩個插入子都存在時則最低。 在 Drp1 基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）和線粒體分裂因子（Mff）敲除 MEFs 的細胞中，外源性表達異構(gòu)體3（同時缺乏A?和B?插入子）可顯著逆轉(zhuǎn)線粒體分裂活性。 然而，當存在A?或B?插入子時，外源性表達異構(gòu)體3 對Mff 敲除的MEF 中的線粒體分裂中沒有產(chǎn)生影響，而在Drp1敲除 MEF 中也只有輕微的逆轉(zhuǎn)作用［8］496?505。

（二）GTPase 結(jié)構(gòu)域

GTPase 結(jié)構(gòu)域不僅對GTP 的結(jié)合起重要作用，而且對Drp1 高階自組裝也起重要作用，且該組裝系統(tǒng)受“80?環(huán)” 調(diào)控［12］。 80?環(huán)可與 GTPase 結(jié)構(gòu)域進行分子間連接，用于高階組裝［12］。 Drp1 二聚體化是線粒體招募和最終在線粒體外膜處進行聚合所必需的［13］. 此外，80?環(huán)的突變可導(dǎo)致 Drp1以單體狀態(tài)存在而無法二聚化［12］。 在異構(gòu)體6、8和9 中，由于 A?插入子的存在，在 80?環(huán)的 Asp83和Gly84 之間延伸了13 個氨基酸殘基。 從結(jié)構(gòu)上看，A?插入子不影響 GTP?Drp1 的結(jié)合親和力。 另外，這個80?環(huán)所延伸的區(qū)域是可被溶酶體、晚期內(nèi)體及漿膜等的識別的一個基序［14］。

（三）可變結(jié)構(gòu)域

Drp1 的可變結(jié)構(gòu)域在導(dǎo)向更高一級螺旋組裝過程中具有非常重要的作用［15］。 可變結(jié)構(gòu)域的靈活性在Drp1 寡聚過程中幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化中是必要的，對環(huán)繞線粒體外膜的Drp1 環(huán)的直徑進行精細調(diào)控［16］。 可變結(jié)構(gòu)域的變異包括不完整的 B?插入子（異構(gòu)體 2、4、5 和 8）和完整 B?插入子的缺失（異構(gòu)體 3 和 9）或存在（異構(gòu)體 1、6、7）。 因此，可變結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)變化會影響Drp1 異構(gòu)體在線粒體中分裂活性。

可變結(jié)構(gòu)域的改變也可能干擾Drp1 的Mff 結(jié)合位點［17］。 當人 Drp1 異構(gòu)體 1 中的可變結(jié)構(gòu)域被敲除時，構(gòu)建體則在Mff 存在下不能形成長鏈聚合物，但在溶液中表現(xiàn)出較高的GTPase 活性［18］?？勺兘Y(jié)構(gòu)域?qū)τ贒rp1 與線粒體外膜上心磷脂的結(jié)合具有重要作用，而在線粒體分裂時，線粒體外膜上缺乏完整的可變結(jié)構(gòu)域的Drp1 異構(gòu)體則無法結(jié)合心磷脂［18，19］。 在線粒體外膜，Mff 可以減輕分子間GTPase 結(jié)構(gòu)體二聚時的空間位阻作用，導(dǎo)致更有效的Drp1 自組裝和聚合以促進線粒體分裂。

二、Drp1 異構(gòu)體在線粒體中的作用

線粒體分裂?融合的協(xié)調(diào)和動態(tài)平衡是產(chǎn)生適當線粒體群體的必要條件，以適應(yīng)各種生理過程和維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。 高表達水平的Drp1 使這種平衡向裂變轉(zhuǎn)移。 在生理條件上，裂變產(chǎn)生更小的線粒體，促進在細胞不同區(qū)域進行線粒體運輸和鈣緩沖作用。 這將提高各種生理過程，如有絲分裂，軸突運輸，突觸形成和 T 細胞活化［20］。

Drp1 是線粒體分裂的主要調(diào)節(jié)因子。 Drp1 在線粒體分裂時轉(zhuǎn)位到線粒體外膜，進而聚合成環(huán)狀結(jié)構(gòu)以誘導(dǎo)分裂。 線粒體分裂由 Drp1 的GTPase活性介導(dǎo)。 與dynamin 類似，在自組裝成聚合物的過程中，Drp1 分子間的合作互動增強了GTPase 酶活性，從而對環(huán)狀結(jié)構(gòu)直徑進行精細調(diào)控，進而促進膜限制［21］。 不同的 Drp1 異構(gòu)體可能會影響這個過程中。

（一）與微管和肌動蛋白的相互作用

微管和肌動蛋白在線粒體運動和胞內(nèi)再分配中具有重要作用。 微管和肌動蛋白相互作用通過影響微管生長和肌動蛋白成核。 反過來，它們調(diào)節(jié)各種細胞事件，如神經(jīng)元發(fā)育，細胞分裂，細胞遷移和細胞極性。 同時，它們也調(diào)控了線粒體的重新分布和重組，而后者涉及線粒體形態(tài)的動態(tài)調(diào)節(jié)。 在胞漿中，大約有一半Drp1 不參與線粒體分裂，而作為Drp1 二聚體和多聚體的異質(zhì)混合物定位于其他細胞室，如微管和肌動蛋白絲等［22］。這些異寡聚體可穩(wěn)定存在于動態(tài)平衡的細胞溶質(zhì)、細胞骨架和線粒體中。 α?和 β?微管蛋白 C?末端殘基與 Drp1 Arg566、Drp1 的 Arg566 和 Arg567產(chǎn)生靜電作用［23］。 這樣的 Drp1 結(jié)構(gòu)體具有較低的線粒體分裂活性，相比于僅包含外顯子16 的結(jié)構(gòu)體［23］。 其可能的機制是這種結(jié)構(gòu)體（等同于異構(gòu)體2）可優(yōu)先結(jié)合到微管，從而干擾Drp1 在線粒體的招募和分裂。

肌動蛋白束也是Drp1 寡聚物的貯存器。 Drp1異構(gòu)體3 可直接與肌動蛋白結(jié)合。 低濃度的肌動蛋白可增強人Drp1 異構(gòu)體3 的GTPase 活性，而高肌動蛋白濃度則使GTPase 活動恢復(fù)到基線水平。這種雙相活性可能與肌動蛋白聚合在線粒體分裂中的作用有關(guān)，包括 Drp1 的招募和寡聚［24］。 然而，不同的Drp1 異構(gòu)體是否對肌動蛋白有不同的傾向，目前仍不清楚。 有研究表明機械傳導(dǎo)和Drp1 之間存在間接相關(guān)性。 例如，單調(diào)拉伸動作可以增加基質(zhì)金屬蛋白酶活性，進而激活ERK1／2表達和刺激大鼠膀胱平滑肌細胞增殖。 對于周期性拉伸反應(yīng)，ERK 依賴的 NF?κB 信號通路活化可促進一氧化氮誘導(dǎo)的大鼠肺泡上皮細胞層的通透性［25］。 ERK1／2 可對 Drp1 的 Ser616 進行磷酸化，從而誘導(dǎo)線粒體分裂并促進血管平滑肌細胞增殖［26］537。 缺血?再灌注對人臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的流體剪切應(yīng)力也可誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和線粒體的分裂。

（二）翻譯后修飾

Drp1 的翻譯后修飾是應(yīng)答于線粒體募集。 可變結(jié)構(gòu)域?qū)⒊蔀镈rp1 的主要調(diào)控區(qū)域。 Drp1 可進行泛素化、SUMO 化修飾和磷酸化。 可變結(jié)構(gòu)域中 Ser616 的磷酸化會導(dǎo)致 Drp1 的激活。Drp1Ser616 可被多種激酶磷酸化，包括 ERK1／2、PKC 及細胞周期蛋白?依賴性激酶 1（CDK1）等［26］538。 CDK1 介導(dǎo)的 Drp1 的絲氨酸殘基磷酸化，可促進有絲分裂細胞的線粒體分裂。 CDK5 調(diào)控的Drp1 的Ser616 磷酸化可誘導(dǎo)胚胎神經(jīng)元成熟過程中的線粒體融合，但在成年有絲分裂后神經(jīng)元中則促進線粒體分裂［27］。

Ser637 位于可變結(jié)構(gòu)域和莖的交界處。 PKA對Ser637 進行磷酸化，可抑制 Drp1 的 GTPase 活性，從而抑制線粒體分裂［28］。 Drp1 的 Ser40／44（異構(gòu)體7 不存在這兩個位點）位于N 末端GT?Pase 結(jié)構(gòu)域內(nèi)，可被糖原合成酶激酶3β（GSK3β）磷酸化而促進線粒體分裂，誘導(dǎo)促進帕金森病模型中的神經(jīng)元對凋亡的敏感性［29］。 相反，GSK3β也可以磷酸化 Ser693，增加其對 H2O2誘導(dǎo)HeLa線粒體斷裂和凋亡的抗性［30］。

Drp1 轉(zhuǎn)位到線粒體誘導(dǎo)分裂并引發(fā)凋亡，可受 SUMO 蛋白（SUMO?1、?2 或?3）和 SUMO 化修飾程度調(diào)控。 因此可通過這種修飾以促進或阻止Drp1 的活性［31］。 Drp1 的關(guān)鍵 SUMO 受體殘基是位于可變結(jié)構(gòu)域的拼接區(qū)域，即Lys532、Lys535、Lys558 和 Lys568。 只有異構(gòu)體 1、6 和 7 含有所有四種賴氨酸殘基。 因此，可以根據(jù)不同的Drp1 異構(gòu)體，預(yù)測不同類型的SUMO 化修飾產(chǎn)物。

三、Drp1 介導(dǎo)的細胞死亡與異構(gòu)體特異性有關(guān)

近年來，Drp1 介導(dǎo)的線粒體裂變常表現(xiàn)為細胞死亡，而也有許多研究表明抑制Drp1 可提高細胞存活率。 這種差異可能與調(diào)節(jié)Drp1 的表達和功能的物種、疾病模型及方法學(xué)不同有關(guān)。 單靠Drp1 誘導(dǎo)的線粒體裂變不足以誘導(dǎo)凋亡。 因此，Drp1 在凋亡中的作用也可能不限于線粒體裂變。另外，Drp1 可直接與Bax 結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)移到線粒體，再通過 Bax／Bak 對 Drp1 進行 SUMO 化修飾以誘導(dǎo)細胞凋亡［32］。 不同Drp1 異構(gòu)體可能參與決定不同的細胞命運。 例如，只有外顯子16 和17 的結(jié)構(gòu)體能夠與抗凋亡因子Bcl?xL 結(jié)合而抑制凋亡［33］。此外，轉(zhuǎn)錄后修飾如磷酸化等，可影響Drp1 向線粒體轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)線粒體分裂和凋亡。 這些修飾作用對不同的Drp1 異構(gòu)體可能產(chǎn)生不同的影響。

四、結(jié)語

人類Drp1 通過三個位點進行剪切形成九種異構(gòu)體。 根據(jù) Drp1 的四個結(jié)構(gòu)域，即 GTPase 結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域、可變結(jié)構(gòu)域和GTPase 效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，各種不同異構(gòu)體由于剪切而存在結(jié)構(gòu)差異，最終導(dǎo)致其在調(diào)控線粒體功能方面出現(xiàn)不同的效果。 不同的Drp1 異構(gòu)體GTPase 的活性存在差異。在不同的細胞中，Drp1 的異構(gòu)體及其病理生理學(xué)活性也會出現(xiàn)特異性。 因此，有必要深入探索Drp1 不同異構(gòu)體在不同組織細胞中調(diào)控機制，為其進一步作為靶標分子開發(fā)奠定基礎(chǔ)。