黃連復(fù)方湯治療胃癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

申嗣琪，李發(fā)展，米陽(yáng)，鄭鵬遠(yuǎn)

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

0 引言

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)編制的Globocan2018年癌癥分析報(bào)告顯示：2018年全球超過(guò)100萬(wàn)例胃癌新病例和78.3萬(wàn)例胃癌死亡病例，胃癌成為全球第五大常見(jiàn)癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。胃癌由于早期缺乏相應(yīng)癥狀，常確診于晚期，因此腫瘤晚期的侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因之一，胃癌晚期的治療常使用序貫化療[2]，但化療藥物為細(xì)胞毒性藥物，常導(dǎo)致抗癌過(guò)程中產(chǎn)生骨髓抑制等嚴(yán)重副作用，降低了患者生活質(zhì)量甚至影響了抗癌效果[3]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有多成分、多途徑、協(xié)同增效的特點(diǎn)，某些成分可有效防止腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，有著巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景[4]。

黃連復(fù)方湯來(lái)源于《圣濟(jì)總錄》卷一七八，包含黃連、干姜、艾葉、烏梅四味中草藥，具有平調(diào)寒熱、和胃降逆的功效，常用于治療感冒、腹瀉、腹痛等[5,6]，有研究發(fā)現(xiàn)烏梅和黃連均有一定抗腫瘤作用[7,8]，但因藥方活性成分多、作用靶點(diǎn)繁復(fù)，具體機(jī)制并未明確。

“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”這一概念由英國(guó)學(xué)者Hopkins首先提出[9]，認(rèn)為藥物治療疾病的作用過(guò)程是“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的[10]，因此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究具有整體性和系統(tǒng)性，與中醫(yī)藥的辨證論治原則、整體觀念相合，可用于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜中藥中的活性成分，進(jìn)而識(shí)別靶標(biāo)和預(yù)測(cè)適應(yīng)證[11]。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出了黃連復(fù)方湯治療胃癌的活性成分和主要作用基因靶標(biāo)，預(yù)測(cè)了黃連復(fù)方湯治療胃癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制。

1 方法

1.1 胃癌靶點(diǎn)-缺氧基因提取

從G S E A（Gene Set Enrichment Analysis）的基因集數(shù)據(jù)庫(kù)中，提取缺氧相關(guān)的基因。在TCGA（The Cancer Genome Atlas Program）的胃癌數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找缺氧基因?qū)?yīng)樣本表達(dá)量，進(jìn)行差異分析，篩選出正常組織和胃癌組織差異表達(dá)的缺氧基因。

1.2 藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索黃連復(fù)方湯含有的四種中藥成分：黃連、干姜、艾葉、烏梅，篩選其中同時(shí)符合口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18條件的活性成分，整理并收集對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將所獲藥物活性成分靶點(diǎn)與差異表達(dá)的缺氧基因?qū)隒ytoscape 3.7.2軟件，繪制中藥成分與缺氧基因的聯(lián)系圖。在此軟件內(nèi)，使用插件BisoGenet 3.0.0，勾選HPRD、BIND、DIP、MINT、INTACT、BIOGRID數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置顯示輸入的節(jié)點(diǎn)及相鄰節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，使用插件CytoNCA分別按照Degree count（61-Max）和Betweenness count（70-Max）進(jìn)行篩選。

1.4 基因富集分析

GO（Gene ontology）分析將基因功能分為生物過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）三部分，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)是系統(tǒng)分析基因功能、鏈接基因組信息和功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。在R軟件中，使用“clusterProfiler”，“richplot”and“ggplot2”對(duì)黃連湯復(fù)方相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路聚集分析，α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05為篩選閾值。

2 結(jié)果

2.1 缺氧基因提取及差異分析

將正常組織和胃癌組織中缺氧基因的表達(dá)情況繪制火山圖，以FDR＜0.05，|logFC|＞1為條件篩選出胃癌組織中顯著上調(diào)或下調(diào)的缺氧基因，并繪制出相應(yīng)火山圖和熱圖（圖1）。結(jié)果顯示，相較于正常組織，在胃癌組織中差異表達(dá)的缺氧基因一共42個(gè)，其中上調(diào)和下調(diào)的基因各21個(gè)。

圖1 缺氧基因表達(dá)差異分析

2.2 詞活性成分及基因靶點(diǎn)

符合OB≥30%，DL≥0.18的黃連復(fù)方湯活性成分共18個(gè)，包括Huanglian(黃連)7個(gè)，Ganjiang(干姜)5個(gè)，Aiye(艾葉)6個(gè)，Wumei(烏梅)6個(gè)，見(jiàn)表1?；钚猿煞謱?duì)應(yīng)765個(gè)基因靶點(diǎn)，去重后獲得186個(gè)基因靶點(diǎn)。

表1 黃連復(fù)方湯活性成分及對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)

2.3 PPI篩選與分析

將藥物活性成分基因靶點(diǎn)與胃癌組織差異表達(dá)的基因做交叉分析，繪制藥物活性成分與缺氧基因的聯(lián)系圖(圖2)，其中JUN作為活性成分山柰酚、β-谷甾醇的基因靶點(diǎn)，F(xiàn)OS、HK2、SERPINE1、CAV1、CDKN1A、JUN、IGFBP3、VEGFA作為活性成分成分槲皮素的共有靶點(diǎn)。

圖2 活性成分與基因聯(lián)系圖

繪制差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖3 a)，并通過(guò)CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能分析，按照deg r ee值(DC＞61，圖3 b)和betweenness值(BC＞7 0，圖3c)篩選排序。其中，按degree值排名前1 5的靶點(diǎn)基因?yàn)镃DKN1A(277)、JUN(273)、NTRK1(242)、TP53(237)、FOS(215)、C A V 1(1 9 9)、E S R 1(1 8 9)、A P P(1 8 2)、EP300(165)、UBC(158)、EGFR(158)、HSP90AA1(158)、CDK2(152)、FN1(140)、CREBBP(134)；按betweenness值排名前15的靶點(diǎn)基因?yàn)門(mén)P53(247.91)、EP300(139.08)、ESR1(1 3 5.1 0)、EGFR(1 3 4.6 1)、HSPA8(1 2 5.8 3)、NTRK1(1 2 5.7 5)、NPM1(12 4.53)、HSP 90A A1(118.7 6)、CDKN1A(1 0 4.3 5)、UBC(1 0 1.7 2)、JUN(90.35)、COPS5(87.77)、TUBB(84.96)、APP(84.45)、MYC(82.29)。

圖3 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將GO分析與KEGG分析結(jié)果(按P值升序排列)分別繪制成氣泡圖、柱狀圖，圖中氣泡大小及柱狀長(zhǎng)短代表富集基因靶點(diǎn)的多少，氣泡及柱體顏色差異代表基因靶點(diǎn)富集的顯著性大小。

G O富集分析結(jié)果(圖4)列出黃連復(fù)方湯治療胃癌涉及的前5條生物過(guò)程(B P)，前5個(gè)細(xì)胞組分(C C)以及前5項(xiàng)分子功能(MF)。BP中，主要是對(duì)老化(aging)、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)(response to oxygen levels)、泌乳(lactation)、體液分泌(bodyfluid secretion)、乳腺發(fā)育(mammary gland development)等生物過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。CC中，主要對(duì)血小板α-顆粒腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α-顆粒(platelet alpha granule)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(RNA polymeraseⅡtranscription regulator complex)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen) 等細(xì)胞組分有顯著作用。MF中，主要對(duì)SMAD相關(guān)蛋白結(jié)合(R-SMAD binding、SMAD binding)、纖維連接蛋白結(jié)合(fibronectin binding)、RNA聚合酶Ⅱ激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymeraseⅡactivating transcription factor binding)、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)等分子功能有顯著作用。

圖4 GO富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果(圖5，6)表明，黃連復(fù)方湯治療胃癌涉及富集潛在基因靶點(diǎn)最多的10條通路依次為缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、血剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma)、p53信號(hào)通路(p53 signaling pathway)、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、恰加斯病(Chagas disease)。提示黃連復(fù)方湯可能通過(guò)以上通路治療胃癌。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 “基因靶向KEGG通路”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

中藥多為口服制劑，在體內(nèi)需經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝及排泄過(guò)程到達(dá)靶器官或組織發(fā)揮作用，此過(guò)程稱為中藥的藥動(dòng)學(xué)特征(即ADME過(guò)程)，其中口服生物利用度(OB)與類(lèi)藥性指數(shù)(DL)是中藥ADME過(guò)程的關(guān)鍵指標(biāo)[4]。

本研究以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選到的黃連復(fù)方湯治療胃癌的主要活性成分為山柰酚、β-谷甾醇和槲皮素等，均已被研究證實(shí)具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫功能等作用[12-19]，說(shuō)明這幾種活性成分可能是黃連復(fù)方湯治療胃癌的藥效基礎(chǔ)。通過(guò)活性成分與基因聯(lián)系圖和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析發(fā)現(xiàn)JUN、CDKN1A、FOS、HK2、SERPINE1、CAV1、IGFBP3、VEGFA等可能是黃連復(fù)方湯治療胃癌的作用靶點(diǎn)。以PPI分析所得degree值排名靠前的關(guān)鍵靶點(diǎn)為例：Kaya等研究表明，CDKN1A基因是參與癌癥發(fā)病機(jī)制的重要腫瘤抑制因子[20]，Shi等研究表明，由CDKN1A基因編碼的p21蛋白是CDK抑制劑的重要成員，p21被廣泛稱為腫瘤抑制因子，但p21還可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展抑制細(xì)胞凋亡，以及有利于遷移而起到致癌因子的作用，因此p21在癌癥中起到了抑制因子或啟動(dòng)子的雙重作用[21]，需要進(jìn)一步研究以確定其作為單個(gè)癌實(shí)體治療分子靶標(biāo)的效用。研究表明，AP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物主要由JUN和FOS蛋白家族的成員組成，而AP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程，與癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與此同時(shí)，JUN、FOS蛋白被認(rèn)為可以發(fā)揮腫瘤抑制功能[22,23]。

GO富集分析中，BP分析表明，細(xì)胞的老化及對(duì)氧氣水平的反應(yīng)等生物過(guò)程受到最顯著的影響，說(shuō)明這些基因主要參與細(xì)胞基礎(chǔ)活動(dòng)的調(diào)控；CC分析表明，說(shuō)明這些基因主要與血小板α-顆粒腔、血小板α-顆粒等細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)相關(guān)細(xì)胞組分的形成或作用通路有關(guān)；MF分析表明，這些基因主要參與藥物產(chǎn)生藥效過(guò)程中的蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子等分子功能。

KEGG通路分析結(jié)果表明黃連復(fù)方湯治療胃癌相關(guān)缺氧基因富集的主要通路包括HIF-1信號(hào)通路、血剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、p53信號(hào)通路等。以HIF-1信號(hào)通路為例進(jìn)行分析：缺氧始終存在于腫瘤微環(huán)境中，是實(shí)體瘤的內(nèi)在特征之一，與腫瘤的侵襲性表型有關(guān)[24]，對(duì)缺氧的大多數(shù)反應(yīng)是一系列缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)引起的，這些轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)各種基因的表達(dá)，這些基因有助于細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，其中HIF-1在癌癥進(jìn)展中的作用已經(jīng)得到充分證實(shí)，HIF-1作為信號(hào)傳導(dǎo)中心，協(xié)調(diào)影響腫瘤發(fā)生的許多轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子的活動(dòng)，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等[25,26]。

4 小結(jié)

黃連復(fù)方湯中的山柰酚、β-谷甾醇和槲皮素成分可能作用于JUN、CDKN1A等缺氧基因是黃連復(fù)方湯治療胃癌的作用機(jī)制，主要為對(duì)細(xì)胞老化及對(duì)氧氣水平的反應(yīng)過(guò)程的調(diào)控，并涉及HIF-1信號(hào)通路、血流剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等。本研究為研究黃連復(fù)方湯治療胃癌提供了初步探討與預(yù)測(cè)，可為后期相關(guān)研究提供理論支持。