Galectin-3 誘導(dǎo)CCL3表達(dá)促進(jìn)椎間盤軟骨終板退變的分子機(jī)制研究

劉巖路，胡煒，汪夢(mèng)琪，黃異飛

（新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院脊柱二科，新疆 烏魯木齊 830000）

0 引言

腰痛（LBP）是一種與脊柱的肌肉及骨骼相關(guān)的最常見的疾病。它最主要的表現(xiàn)為肋緣以及臀下皺襞之間產(chǎn)生的疼痛，包括僵硬與肌肉緊張，甚至?xí)绊懴リP(guān)節(jié)以下，小腿的周圍的神經(jīng)根甚至小腿疼痛[1]。全世界的LBP發(fā)生比例約為85%，在任意給定時(shí)間，任意年齡段的LBP的發(fā)生率約為18%[1]。除此之外，每個(gè)人在一生當(dāng)中，經(jīng)歷LBP的可能性約為80%[2]。目前，腰背痛（LBP）已經(jīng)成為一種全球性質(zhì)的與醫(yī)療保健相關(guān)的問(wèn)題，比任何其他疾病都更能引起全球性的殘疾[3]。嚴(yán)重的影響了患者的心理健康、生活質(zhì)量以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。伴隨著全球人口的老齡化，與LBP疾病相關(guān)的多種負(fù)擔(dān)會(huì)以指數(shù)級(jí)增加[4-5]。在臨床診療中，LBP可能引起多種疾病的相關(guān)癥狀，而腰椎間盤的退變是導(dǎo)致LBP產(chǎn)生的最主要因素[6]。單從形態(tài)學(xué)上來(lái)說(shuō)，腰椎間盤內(nèi)并無(wú)血管走行，而椎間盤內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)及代謝物質(zhì)的運(yùn)輸最主要是依靠軟骨終板來(lái)完成的[7]。只要腰椎間盤出現(xiàn)了退變的現(xiàn)象，就會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致椎間盤軟骨終板出現(xiàn)撕裂、硬化，從而進(jìn)一步導(dǎo)致椎管狹窄、椎間隙變窄等一系列臨床問(wèn)題，最后導(dǎo)致腰椎間盤的形狀、穩(wěn)定性及功能的缺失，使得LBP發(fā)生與惡化[8-10]。

Galectin-3是一種質(zhì)量大小為29至35kDa之間的蛋白質(zhì)，屬于β-半乳糖苷結(jié)合類動(dòng)物凝集素家族，在多種組織中都有表達(dá)。近年發(fā)現(xiàn)[11]，半乳糖凝集素 Galectin-3可被作為細(xì)胞標(biāo)記物和促生存因子，細(xì)胞及軟骨細(xì)胞之間相互作用的調(diào)節(jié)類因子，是一種靶蛋白與MMPs活性的調(diào)節(jié)類因子。預(yù)測(cè) Galectin-3 可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)從而在脊柱退變中發(fā)揮作用。為此項(xiàng)目組在前期工作基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步以軟骨終板退變?yōu)榍腥朦c(diǎn)，系統(tǒng)研究和確立半乳糖凝集素 Galectin-3 通過(guò)激活 MMPs、Aggrecan等蛋白降解酶正調(diào)節(jié)CCL3 在軟骨終板中的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞遷移并進(jìn)一步闡明調(diào)節(jié) CCL3 表達(dá)的分子作用機(jī)制，從全新的方面來(lái)闡述了椎間盤軟骨終板退變可能的作用及相關(guān)機(jī)制。借此為建立通過(guò)干預(yù) Galectin-3延緩脊柱退變的治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞和大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)基，Procell，中國(guó)；MTT試劑盒，BIOFROX，中國(guó)；Fetal Bovine Serum，Penicillin-Streptomycin，Trypsin-EDTA (0.25%)， phenol red，GIBCO，美國(guó)；TIANScript RT Kit，SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen），天根，中國(guó)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Solarbio，中國(guó)；CCL3 Rabbit pAb(A7568)， Abclonal，中國(guó)；Anti-MMP3抗體[EP1186Y]， Abcam， 美國(guó)；Aggrecan Polyclonal Antibody，Proteintech，中國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代

將大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞從低溫液氮里取出，然后快速放入37℃的水浴鍋當(dāng)中，然后輕輕搖動(dòng)凍存管，使得凍存液溶解；待溶解以后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另含有5mL培養(yǎng)基的離心管之中，離心法收集細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基來(lái)懸浮細(xì)胞，然后接種到培養(yǎng)皿中，并且輕輕吹打來(lái)混勻，在37℃ 5%CO2的飽和濕度條件下來(lái)培養(yǎng)。間隔每2天都更換培養(yǎng)液一次。待細(xì)胞融合到80%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA來(lái)收集細(xì)胞，按照1:3來(lái)傳代，最后取 P2 代的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞存活率分析

取正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)良好的大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔，接入96孔板，同時(shí)設(shè)空白組對(duì)照，使用37℃培養(yǎng)條件過(guò)夜（并且在所有細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100μL無(wú)菌PBS），然后按以下分組條件對(duì)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行處理：對(duì)照組和Galectin-3抑制劑組（GB1107 25uM），處理的時(shí)間分別為12h、24h、48h。在指定時(shí)間之內(nèi)，每個(gè)孔都加入10μLMTT，37℃溫度條件下培養(yǎng)4h；而后吸出培養(yǎng)基組織，加入150μLDMSO震蕩10min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔的吸光值OD 568。 所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 RT-qPCR

通過(guò)DNAMAN軟件設(shè)計(jì)MMP3、Aggrecan、CCL3熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，由上海生工有限公司生產(chǎn)合成。分別加入2μL5×PrimeScript Buffer，0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo（dT）15 (15μM)，0.5 μLRandom 6 mers (100μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達(dá)到10μL，混勻后短暫離心，放于PCR儀上37℃溫度條件下溫浴15min，85 ℃溫度條件下加熱5s，稀釋至35μL，即得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA。qPCR反應(yīng)：Forward primer 10 μM 0.8μL，0.8 μLReverse primer 10μM，2XSYBR Select Master Mix (2×) 10μL，RNase-free water 6.4 μL，cDNA template 2μL，配制成20μL體系且混合均勻，放在儀器上持續(xù)保持95℃，1 min，95℃，10s，60℃ 34s，做40個(gè)循環(huán)，94℃ 1min 30s，60℃ 1min，60℃→94℃，1.1℃/s升溫，從而最終獲得qPCR反應(yīng)的結(jié)果，使用2-ΔΔCt方法用于結(jié)果量化計(jì)算。

1.2.4 Western-Blot

將PBS洗凈細(xì)胞中加入120μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，在4℃溫度條件下12000rpm轉(zhuǎn)速離心5min后，取適量稀釋的上清溶液，使用 BCA測(cè)定法來(lái)測(cè)定蛋白的濃度，在調(diào)整蛋白質(zhì)濃度之后，使用免疫印跡法( Western blot) 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP3、Aggrecan、CCL3的表達(dá)，步驟大致如下：經(jīng)過(guò)灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜之后，將膜裝入含量5% 的牛血清白蛋白(BSA)封閉液當(dāng)中，放置室溫?fù)u床中1h，并加入5mL（1:1000）一抗稀釋液在4℃冰箱中過(guò)夜。然后加入10mL(1:50000 )二抗稀釋液并置于搖床上2h后，顯色，在暗室里壓片至曝光顯影，結(jié)果使用 Quantity-one圖像軟件分析后并進(jìn)行光密度值掃描計(jì)算，分別來(lái)計(jì)算目的蛋白條帶及GAPDH強(qiáng)度的比值關(guān)系( % ) 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT的檢測(cè)結(jié)果

使用MTT檢測(cè)方法，Galectin-3抑制劑組（GB1107 25uM）在不同的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行的細(xì)胞活性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終如圖1所示。在Galectin-3抑制劑GB1107干預(yù)條件下，大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞在12h的時(shí)間開始，細(xì)胞活性開始逐漸降低，隨著時(shí)間的不斷推移，細(xì)胞的活性不斷的在下降。在24h抑制劑作用下，抑制細(xì)胞的活性率最終可達(dá)69%，在48h時(shí)，細(xì)胞活性持續(xù)降低，最終達(dá)到54%。3個(gè)時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞活性都與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。因此，這些數(shù)據(jù)可以證明細(xì)胞的增殖的能力與Galectin-3抑制劑作用時(shí)間成負(fù)相關(guān)。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)和對(duì)大鼠軟骨終板細(xì)胞活性的影響

2.2 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的基因表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法來(lái)定量檢測(cè)兩組大鼠軟骨終板細(xì)胞當(dāng)中MMP3、Aggrecan、CCL3的mRNA表達(dá)情況，具體見圖2。在加入Galectin-3抑制劑GB1107 25uM組的大鼠軟骨終板細(xì)胞中MMP3、Aggrecan、CCL3 mRNA表達(dá)量較于對(duì)照組顯著降低，P<0.05。

圖2 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的基因表達(dá)情況

2.3 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表達(dá)差異

采用Western blot法檢測(cè)兩組大鼠軟骨終板細(xì)胞中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表達(dá)差異性，具體見圖3。在加入Galectin-3抑制劑GB1107 25uM組的大鼠軟骨終板細(xì)胞中MMP3、Aggrecan、CCL3 蛋白表達(dá)量較于對(duì)照組顯著降低，P<0.05。

圖3 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表達(dá)差異

3 討論

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是一類椎間盤自然產(chǎn)生退化的生理病理的自然過(guò)程。自上世紀(jì)初，通過(guò)對(duì)椎間盤退變的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其致病主要因素包括：應(yīng)力的損傷、炎癥反應(yīng)、衰老、感染、營(yíng)養(yǎng)過(guò)程的障礙、遺傳以及腫瘤等，這些因素會(huì)導(dǎo)致IVDD的發(fā)生和惡化[12-13]。軟骨終板成分是椎間盤的非常重要組成部分，它在維持脊柱椎體的正常形態(tài)，保護(hù)椎體承受各種壓力，并且吸收靜態(tài)的壓力等方面起到積極的作用，同時(shí)終板組織又是椎體當(dāng)中滲透轉(zhuǎn)運(yùn)能力的最主要的承擔(dān)者，是椎體骨組織中主要營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)通路[14]。終板的退變老化與IVDD的產(chǎn)生有著十分密切的聯(lián)系。但至今其中的確切機(jī)制仍不清楚。

本次研究首次通過(guò)研究Galectin-3與MMP3、Aggrecan、CCL3在椎間盤軟骨終板內(nèi)的相互關(guān)系，闡明軟骨終板退變的可能作用機(jī)制。椎體終板組織主要是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外的基質(zhì)組織（extracellular matrix，ECM）組成。基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）是一種能夠降解 ECM 的降解酶。已有研究表明[15]，當(dāng)軟骨終板受損時(shí)，會(huì)使基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增加，抑制物表達(dá)降低，加劇ECM的降解，誘導(dǎo)軟骨終板的破壞，導(dǎo)致軟骨終板退變。MMP3在軟骨破損中起到級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，降解蛋白多糖，在軟骨終板中起到至關(guān)重要的作用[16]。李龍滕[17]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，患者關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)液當(dāng)中MMP3的表達(dá)量顯著增高，表明MMP3可能是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退化的最重要細(xì)胞因子之一。朱新輝等[18]也通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，MMP3水平與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎病變嚴(yán)重的程度(Kellgren-Lawrence分級(jí))呈現(xiàn)正相關(guān)。

聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是椎間盤里蛋白聚糖當(dāng)中最主要的一種，在椎間盤內(nèi)起到滲透和抗機(jī)械壓載荷的作用[19]。Aggrecan對(duì)軟骨基質(zhì)的降解起到非常重要的作用[19]。當(dāng)軟骨終板受損，會(huì)導(dǎo)致蛋白聚糖的丟失而脫水，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解，然后誘導(dǎo)軟骨終板的退變，同時(shí)隨著重復(fù)的損傷而進(jìn)一步增強(qiáng)[20-21]。溫俊等[22]人通過(guò)對(duì)大鼠的Aggrecan基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Aggrecan可以降低基質(zhì)的降解，緩解關(guān)節(jié)軟骨的退變。

CCL3又被稱做巨噬細(xì)胞炎性蛋白，其具有募集巨噬細(xì)胞的重要功能。而且在炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答中都發(fā)揮著重要的作用[23]。CCL3的表達(dá)會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生遷移。有研究證明[24]，CCL3的表達(dá)的水平與椎間盤退變的程度呈正相關(guān)性，表明 CCL3 可能具有促進(jìn)椎間盤退變的作用。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在Galectin-3抑制劑組當(dāng)中，細(xì)胞活性顯著降低，MMP3、Aggrecan、CCL3的基因和蛋白表達(dá)量明顯減少，表明Galectin-3與細(xì)胞活性、MMP3、Aggrecan、CCL3之間成正相關(guān)。我們推測(cè)抑制Galectin-3的表達(dá)，可以降低MMP3、Aggrecan對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減少CCL3對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的作用，進(jìn)而抑制軟骨終板的退變。在全新方面闡述了軟骨終板退變可能出現(xiàn)的作用機(jī)制，這為椎間盤退變的診斷提供了更多更新的思路與方向，在臨床上可用于其表達(dá)水平來(lái)判斷治療，為預(yù)防和治療椎間盤軟骨終板退變及相關(guān)的疾病研究提供新的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。