植物雜交技術(shù)在本科教學(xué)中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與應(yīng)用*

劉華彬 王 玲 杜展顏 王 松

（安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院 安徽鳳陽(yáng) 233100）

植物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是開(kāi)展植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)研究的重要工具。在遺傳學(xué)研究中，植物有性雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中。植物的雜種優(yōu)勢(shì)是自然界普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，即利用具有不同遺傳組成（基因組）的同種或不同種生物個(gè)體，通過(guò)雜交以獲得具有父本和母本優(yōu)勢(shì)性狀的子代個(gè)體。在生物遺傳育種、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及遺傳分析中具有重要意義。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為經(jīng)典的模式植物，具備模式生物的重要特征，例如，生長(zhǎng)周期較短、結(jié)實(shí)率高、基因組小、易于培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化等，是第1種完成全基因組測(cè)序的植物[1]，因此，被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究之中。在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中，利用擬南芥生長(zhǎng)周期短的特征，可在較短的時(shí)間內(nèi)獲得所需的實(shí)驗(yàn)材料。植物有性雜交技術(shù)是經(jīng)典的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，是研究植物的遺傳機(jī)制和作物遺傳育種的重要工具。

1 實(shí)驗(yàn)原理

植物雜交是基因重新組合的過(guò)程，通過(guò)有性雜交將親本雙方控制不同性狀的基因整合至雜交子一代個(gè)體中，從而使子代獲得雙親的優(yōu)良性狀，在植物個(gè)體的生長(zhǎng)、產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和適應(yīng)環(huán)境能力等方面表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)，最終獲得符合生產(chǎn)需求的新品種。植物雜交也是植物進(jìn)行有性生殖的過(guò)程，雙受精是被子植物所特有的生殖現(xiàn)象[2]。在這一過(guò)程中，成熟的花粉通過(guò)昆蟲、風(fēng)力或其他外界條件影響，傳送至柱頭上并與之相互識(shí)別進(jìn)而完成授粉[3]。在一些自然授粉效率較低的植物中或在作物遺傳育種中，常需要進(jìn)行人工授粉，即通過(guò)人工操作將植物的花粉傳送至柱頭上以幫助其授粉[4-7]。在植物遺傳分析和作物育種過(guò)程中，通過(guò)有目的地選擇親本進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)以實(shí)現(xiàn)方向性改變植物的遺傳特征[6-7]?；ǚ圩鳛楦副具z傳信息的攜帶者，授粉成功后形成的子一代繼承了雙親的遺傳性狀[8-10]。在植物雜交育種實(shí)驗(yàn)中，可通過(guò)表型觀察或遺傳信息鑒定F1代雜合植株。

2 教學(xué)安排與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 教學(xué)目的 掌握種子植物的人工授粉技術(shù)，了解種子的形成過(guò)程；掌握雜種植株鑒定技術(shù)。

2.2 教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)

1）重點(diǎn)：父本和母本的選擇，人工授粉。

2）難點(diǎn)：去雄操作，F(xiàn)1雜合植株鑒定。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

植物材料：生長(zhǎng)5～6周的擬南芥植株，處于旺盛的開(kāi)花期。

實(shí)驗(yàn)器具：正置熒光顯微鏡、光照培養(yǎng)箱、雜交鑷子、保鮮膜。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 以突變體擬南芥（mutant，m）為母本，攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因擬南芥（A-GFP）為父本，進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。

2.4 教學(xué)安排

本實(shí)驗(yàn)共分為5個(gè)階段：1）植物的培養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)教師完成）；2）父本和母本的選擇，以及人工去雄（2學(xué)時(shí)）；3）人工雜交（2學(xué)時(shí)）；4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察（2學(xué)時(shí)）；5）F1雜合植株鑒定（2學(xué)時(shí)）。

實(shí)驗(yàn)中2～3位學(xué)生為一組，每位組員都要進(jìn)行一次完整的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，積極分享和討論實(shí)驗(yàn)中的技術(shù)要點(diǎn)，共同觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)失敗的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析和總結(jié)。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果觀察

3.1 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備 培養(yǎng)5～6周的擬南芥，處于旺盛的開(kāi)花期（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)材料和器具的準(zhǔn)備

3.2 父本、母本的選擇 父本選取開(kāi)花旺盛的13～14期的擬南芥花[11]，花瓣完全舒展開(kāi)，呈十字形（圖2A）。每朵花中包含6枚雄蕊，4長(zhǎng)2短，雄蕊位于雌蕊的周圍、花瓣的內(nèi)部，花藥呈黃色，表明此時(shí)期的花粉已成熟。若雄蕊已成熟，而雌蕊尚未發(fā)育或雌蕊狀態(tài)不佳，可先將取下的花藥置于保鮮袋或無(wú)菌的離心管中，4℃低溫冰箱內(nèi)密封保存3～5 d。待母本花期適宜時(shí)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的花蕾進(jìn)行去雄，然后即可進(jìn)行人工授粉。

母本的選擇應(yīng)確保雌蕊尚未進(jìn)行授粉。選取未開(kāi)放的9～12期的花[12]，花蕾較多的分枝或主枝，此時(shí)，整朵花被白色的花瓣和綠色的萼片緊緊包住，在花的頂端只露出一點(diǎn)白色（圖2B）。用75%乙醇對(duì)鑷子進(jìn)行消毒，將選定的母本花蕾進(jìn)行人工去雄，并用保鮮膜包裹，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，等待柱頭長(zhǎng)大呈現(xiàn)毛茸茸的狀態(tài)（圖2C）。

圖2 擬南芥人工授粉

3.3 擬南芥有性雜交 待雌蕊的柱頭呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)毛茸茸的狀態(tài)（圖2C），此時(shí)進(jìn)行授粉的成功率顯著提高。首先，用75%乙醇對(duì)鑷子進(jìn)行消毒；用消過(guò)毒的鑷子夾住成熟雄蕊的花絲，將花藥在雌蕊的柱頭上來(lái)回摩擦、涂抹幾次（圖2D）。人工授粉后，用保鮮膜將雌蕊套袋，防止外界的花粉落到柱頭上干擾實(shí)驗(yàn)。授粉時(shí)間一般在上午9∶00—11∶00之間為佳。

在對(duì)雜交的父本、母本進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，母本（雌蕊）一般用F（female）或♀表示，父本（雄蕊）一般用M（male）或♂表示。例如，突變體（mutant）作母本，轉(zhuǎn)基因擬南芥A-GFP作父本，則標(biāo)簽上應(yīng)記錄為m（F）×A-GFP（M）-F1，F(xiàn)1代表雜交產(chǎn)生的第1代種子。

3.4 雜交后實(shí)驗(yàn)觀察 人工授粉后1～2 d，觀察柱頭的生長(zhǎng)情況。如果柱頭長(zhǎng)大，花柱伸長(zhǎng)，則表明雜交成功；如果柱頭未發(fā)育長(zhǎng)大，則說(shuō)明雜交失?。▓D2E）。此時(shí)，要仔細(xì)觀察柱頭的形態(tài)，如果柱頭仍為毛茸茸的狀態(tài)，可再進(jìn)行一次人工授粉；如果柱頭出現(xiàn)萎蔫或干枯，則表明雜交失敗，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將植株置于光照培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)，一般3～7 d，角果即可顯著伸長(zhǎng)（圖2E）。待種子成熟后即可收取F1種子，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3.5 F1雜合植株鑒定 F1雜合植株繼承了雙親的遺傳信息，因此，雜合植株表現(xiàn)出親本的遺傳性狀。F1代雜合植株的鑒定，只需鑒定F1植株基因組是否含有父本的遺傳信息即可，這主要是由于來(lái)自父本的花粉傳粉至母本雌蕊的柱頭上，并成功完成授粉，則發(fā)育形成的種子及其F1代植株均含有來(lái)自于父本的遺傳信息。因此，可對(duì)F1代植株是否包含來(lái)自于父本的遺傳信息或表現(xiàn)出父本的遺傳性狀進(jìn)行鑒定。

綠色熒光蛋白編碼基因是一種廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中的標(biāo)記基因，GFP在波段為395～490 nm的激發(fā)光作用下發(fā)出獨(dú)特的綠色熒光[13-14]。在植物學(xué)研究和作物雜交等相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，?？衫肎FP作為父本遺傳信息的標(biāo)記基因[14-15]。在對(duì)F1代雜合植株鑒定時(shí)只需對(duì)其進(jìn)行GFP熒光觀察，如果F1代植株在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光則表明其為雜合植株；如果觀察不到綠色熒光則表明雜交失敗。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)F1植株進(jìn)行鑒定時(shí)，取雜交成功后的成熟種子，經(jīng)消毒后在MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)并豎直培養(yǎng)7 d，待植物根系長(zhǎng)至1.5～2.0 cm左右，將植物幼苗置于熒光顯微鏡下使用GFP激發(fā)光激發(fā)，進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)選用mutant（m）作為母本（無(wú)熒光標(biāo)記基因，圖3A和3B），A-GFP作為父本的標(biāo)記基因（圖3C），F(xiàn)1代（m×A-GFP）植株經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡觀察到綠色熒光（圖3D），表明雜交成功，即F1為雜合植株。

圖3 F1代雜合植株鑒定

4 討論

4.1 教學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)的意義 擬南芥作為科學(xué)研究中的模式植物，被稱為植物界的“果蠅”。了解擬南芥植物的生長(zhǎng)習(xí)性和繁殖器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)，掌握科學(xué)研究中的基本實(shí)驗(yàn)技能，是培養(yǎng)大學(xué)生科研興趣和動(dòng)手能力最好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)，可使學(xué)生了解植物培養(yǎng)的基本方法、掌握雜交育種的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

4.2 實(shí)驗(yàn)課程安排與教學(xué)計(jì)劃 該實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟、穩(wěn)定，結(jié)果直觀可靠且易獲得。大多數(shù)高校實(shí)驗(yàn)室都具有本實(shí)驗(yàn)使用的實(shí)驗(yàn)儀器，例如，正置熒光顯微鏡、植物光照培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室等，具備開(kāi)設(shè)本實(shí)驗(yàn)的條件。

本實(shí)驗(yàn)課程作為遺傳育種學(xué)實(shí)驗(yàn)課或本科生科研專題訓(xùn)練項(xiàng)目，建議4次實(shí)驗(yàn)課（8學(xué)時(shí)）為宜；由實(shí)驗(yàn)教師完成植物的培養(yǎng)，學(xué)生主要進(jìn)行去雄、雜交與鑒定實(shí)驗(yàn)。

4.3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中注意事項(xiàng) 本實(shí)驗(yàn)成功率的高低在于對(duì)母本的選擇及人工去雄的操作技巧。母本選擇尚未授粉的雌蕊，此時(shí)的花蕾處于發(fā)育早期，在花蕾的頂端剛好露出一點(diǎn)白色花瓣。在去雄操作中，一定注意動(dòng)作的輕緩，不要觸碰或弄傷雌蕊。在雜交過(guò)程中，鑷子要保持干凈，每進(jìn)行一次雜交實(shí)驗(yàn)，都要清潔鑷子尖端殘存的花粉粒，以免其他花粉粒落到柱頭上干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.4 本實(shí)驗(yàn)課在高校教學(xué)中的應(yīng)用 該實(shí)驗(yàn)是認(rèn)識(shí)植物生長(zhǎng)繁育規(guī)律、掌握植物基本實(shí)驗(yàn)技能的實(shí)踐課。要求教師將完整的知識(shí)體系、實(shí)驗(yàn)原理、操作技巧、注意事項(xiàng)詳細(xì)地展現(xiàn)給學(xué)生，讓學(xué)生既能領(lǐng)會(huì)到植物世界的奧妙，又能學(xué)到科學(xué)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能。經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)，學(xué)生既能了解植物生長(zhǎng)發(fā)育和繁育后代的生命過(guò)程，又能掌握學(xué)科理論知識(shí)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)技巧和基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。