柱前衍生化氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測平菇中吡蟲啉的殘留量

曲 瀅，查欣欣，沈 鵬，葉 劍，王洪雷

（1.江蘇恒生檢測有限公司，南京 210046；2.江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司，南京 210046）

吡蟲啉（Imidacloprid），化學名稱為(E)-1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺（圖1），是一種具有內(nèi)吸性的新煙堿類殺蟲劑，為后突觸煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）的激動劑，作用于昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作用方式為層間傳導，具有觸殺和胃毒作用[1]。吡蟲啉在土壤、動物和植物中均容易發(fā)生降解代謝，土壤中最重要的代謝途徑為咪唑啉環(huán)羥氧化、還原或失去硝基，水解為6-氯煙酸；在植物體內(nèi)主要代謝途徑為吡蟲啉通過失去硝基、咪唑啉環(huán)羥基化水解為6-氯煙酸（圖2），主要代謝物為吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、吡蟲啉胍、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸，所有代謝物都含有6-氯-吡啶基部分[2]。

圖1 吡蟲啉結(jié)構式

圖2 6-氯煙酸結(jié)構式

目前關于吡蟲啉檢測方法較多，主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，如采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術檢測吡蟲啉母體和苯醚甲環(huán)唑在蕹菜、秋葵等蔬菜中的殘留[3-8]。并且對吡蟲啉代謝物的研究多為單獨檢測吡蟲啉胍、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸[9-11]。而農(nóng)藥殘留化學評估時，會同時參考GB 2763—2021[12]和JMPR[3]對殘留的定義，JMPR對評估膳食攝入的吡蟲啉殘留量定義為吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基的代謝物之和。有關基于該定義研究吡蟲啉的檢測方法較少。因此，本研究通過柱前衍生方法，加入N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），將吡蟲啉和代謝物轉(zhuǎn)化為6-氯煙酸三甲基硅酯（圖3）[3]，通過優(yōu)化儀器檢測和前處理反應條件等因素，同時對平菇中吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基代謝物的殘留總量進行檢測分析，為吡蟲啉在農(nóng)藥殘留化學評估的膳食風險攝入評估提供技術支撐。

圖3 6-氯煙酸三甲基硅酯結(jié)構式

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：平菇，江蘇恒生檢測有限公司；99.1%吡蟲啉標準品，北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司；99.21%6-氯煙酸標準品，Dr·Ehrenstorfer公司。

試劑：高錳酸鉀、硫酸（分析純），南京化學試劑股份有限公司；N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA）硅烷化試劑，美國Regis公司；甲基叔丁醚、乙腈、正己烷（色譜純），美國天地有限公司；氯化鈉、無水亞硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），科密歐化學試劑有限公司；超純水，默克化工技術有限公司。

儀器：濾膜（0.22 μm，有機系），津騰試驗設備有限公司；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技公司；AL204萬分之一天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AM600刀式研磨儀，螞蟻源科學儀器有限公司；SSW-420-2S電熱恒溫水槽，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 儀器檢測條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱溫度：100℃，保持1 min，然后以10℃/min升溫至200℃，再以40℃/min升溫至250℃；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；保留時間：7.7 min左右；電離方式：EI；電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲：3 min；MRM多反應監(jiān)測；質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 6-氯煙酸三甲基硅酯質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.3 樣品的提取及衍生化

準確稱取2.0 g平菇樣品于50 mL 塑料離心管中，加入5 mL超純水和10 mL乙腈，振蕩20 min，加入5 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min后以5 000 r/min離心5 min，定量吸取5 mL上清液于濃縮瓶后濃縮至近干，加入10 mL堿性KMnO4溶液，在70℃水浴反應10 min取出冷卻，溫度低于15℃時，加入10%稀硫酸溶液酸化，加入1 g無水亞硫酸鈉，溶液顏色由紫紅色變?yōu)榍煽肆ψ兀ǘ趸i）后變?yōu)闊o色透明，確定pH＜1；用10 mL甲基叔丁醚（MTBE）液液萃取2次，取全部上清液轉(zhuǎn)移至氮吹瓶吹干，2 mL正己烷復溶后，加入25 μL MSTFA，渦旋振蕩30 s，反應為6-氯煙酸三甲基硅酯，過0.22 μm有機濾膜進氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.4 標準儲備液的配制和衍生化

準確稱取0.010 2 g 6-氯煙酸標準品，用乙腈定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1 012 mg/L的標準儲備液，用乙腈稀釋為10 mg/L的標準工作溶液待衍生化；準確移取2 mL 10 mg/L標準工作溶液入氮吹瓶吹干，2 mL正己烷復溶后，加入25 μL MSTFA進行衍生反應為6-氯煙酸三甲基硅酯，于0～4℃保存。

稱取0.010 4 g吡蟲啉標準品，用乙腈定容至10 mL，得到濃度為1 031 mg/L標準儲備液，用乙腈梯度稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為10和1 mg/L標準工作溶液，制備成0.02、0.05和0.5 mg/kg的添加樣品，于0～4℃保存。

1.5 標準溶液制備及標準曲線的繪制

將濃度為10 mg/L的6-氯煙酸三甲基硅酯用平菇基質(zhì)空白溶液逐級稀釋，配制成濃度分別為0.002、0.005、0.02、0.05、0.2 mg/L的系列標準工作溶液。在1.2所述色譜條件下進行測定，以其質(zhì)量濃度和峰面積為橫、縱坐標，繪制標準曲線。

1.6 計算

樣品的檢測對象為6-氯煙酸三甲基硅酯標準溶液濃度，因此樣品中的吡蟲啉殘留量（吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基的代謝物之和）需用稀釋因子折算[13]。按式（1）和（2）分別計算樣品檢測濃度和回收率。

式中：Cs為樣品中吡蟲啉的檢測濃度，mg/kg；m為稱樣量，g；V為定容體積，mL；n為稀釋因子；A為樣品峰面積，mAU·min；b為標準曲線截距；a為標準曲線斜率。

式中：r為回收率；Cs為樣品的檢測濃度，mg/kg；Ct為添加濃度，mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 最終衍生物質(zhì)譜結(jié)果分析

吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基的代謝物基通過加入N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），發(fā)生硅烷化，轉(zhuǎn)化為6-氯煙酸三甲基硅酯。利用安捷倫自動優(yōu)化軟件Optimizer進行二極質(zhì)譜分析，根據(jù)最終優(yōu)化結(jié)果，離子強度最大的112為定量離子，離子強度次之的140、170.1為定性離子[14]。在電子轟擊離子源（EI）檢測模式進行全掃（MS2Scan），選擇質(zhì)荷和絕對強度較大的離子214為6-氯煙酸三甲基硅酯前體離子，6-氯煙酸三甲基硅酯質(zhì)譜圖見圖4。

圖4 定量定性離子對的質(zhì)譜圖

2.2 線性范圍

在0.002～0.2 mg/L范圍內(nèi)，6-氯煙酸三甲基硅酯的線性方程為y=600 843.555 466x＋409.212 699，R2=0.999 5，R2＞0.999，則工作溶液在0.002～0.2 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好，符合檢測要求[15]，見圖5。

圖5 6-氯煙酸三甲基硅酯的標準曲線圖

吡蟲啉在平菇上的定量限為0.02 mg/kg，符合準則中定量限為0.01～0.05 mg/kg的要求[16]。

2.3 準確度和精密度

目前尚未制定吡蟲啉在平菇中的MRL值，因此吡蟲啉在平菇基質(zhì)空白樣品中添加濃度設置為0.02、0.05和0.5 mg/kg，符合準則中如果尚未制定MRL值，添加水平應包括定量限和高于10倍定量限的濃度的要求[16]。準確度以平均回收率表示，吡蟲啉加標平均回收率為86%～95%；精密度以相對標準偏差表示，其相對標準偏差為1.7%～4.8%，具體結(jié)果見表2。結(jié)果表明該方法準確度和精密度良好，穩(wěn)定可靠。

表2 吡蟲啉加標平均回收率及相對標準偏差（n=5）

3 結(jié) 論

本研究創(chuàng)新性地建立了一種柱前衍生法對平菇中吡蟲啉殘留物進行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定分析。平菇樣品中的吡蟲啉及其代謝物經(jīng)乙腈提取，在堿性KMnO4溶液和70℃水浴條件下氧化反應轉(zhuǎn)化為含6-氯-煙酸吡啶基的代謝物，經(jīng)甲基叔丁醚萃取濃縮，正己烷復溶，N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA）衍生為6-氯煙酸三甲基硅酯。通過最終衍生物質(zhì)譜分析，并采用GC-MS/MS測定，對吡蟲啉在平菇中的平均回收率為86%～95%，相對標準偏差為1.7%～4.8%。本研究結(jié)果表明，該方法操作簡單方便、高效準確，適用于平菇中吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基代謝物的殘留總量的檢測。