北京市延慶區(qū)?？谔阋呙庖呖贵w檢測與防控

王艾晶

北京市延慶區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京延慶 102100

0 引言

?？谔阋哂址Q為“口瘡”，是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（WHO）列為法定上報的動物傳染病，我國將其列為重點防范的一類傳染病?？谔阋卟《疽装l(fā)生變異，目前有7 個血清型：A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3、Aisa I，我國主要流行的是A型、O型和Aisa I型，但在2009年后Aisa I型未見報道[1]。

口蹄疫臨床典型特點是口腔黏膜、蹄部和乳房出現(xiàn)水泡，且水泡中存在大量病毒?？谔阋邼摲谝话銥?～4 天，最長可達7 天，牛體溫突然升高至40～41 ℃，精神不振，食欲減退，流口水，唇內(nèi)、舌面等處出現(xiàn)水泡，口水漸變成白色泡沫，水泡破裂后變成糜爛組織，嚴(yán)重影響奶牛采食、走路和泌乳。犢牛感染口蹄疫后常伴有心肌受損或出血性腸炎，故死亡率較高。

口蹄疫傳播速度快、途徑多、范圍廣，病牛及其分泌物或排泄物或精液都是污染源；通過消化道、皮膚黏膜和呼吸道均能感染該病，嚴(yán)重危害了牛群健康，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大經(jīng)濟損失。北京市延慶區(qū)是北京市奶牛存欄量較大的區(qū)，對北京市奶牛業(yè)的發(fā)展起到舉足輕重的作用。因此要全面了解和精準(zhǔn)掌握該區(qū)口蹄疫的發(fā)生風(fēng)險，科學(xué)應(yīng)對口蹄疫免疫和檢測工作中存在的問題，努力采取綜合防控措施為首都奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展保駕護航。

1 延慶區(qū)?？谔阋呙庖郀顩r

畜禽免疫是有效防控動物疫情，人畜共患病發(fā)生的基礎(chǔ)性工作。根據(jù)北京市動物免疫計劃，結(jié)合延慶區(qū)實際情況，實行養(yǎng)殖場程序化免疫，散養(yǎng)戶集中免疫與查漏補針相結(jié)合的工作模式，確保應(yīng)免免疫密度達到100%。程序化免疫由養(yǎng)殖場（戶）自行組織實施，動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)做好免疫督導(dǎo)檢查和免疫效果監(jiān)測評估；對不具備自行免疫能力的散養(yǎng)戶在每年3月、7月、11月開展集中免疫工作，其余時間進行查漏補免，免疫操作由包片獸醫(yī)和村級防疫員入村入戶實施完成，努力做到村不漏戶，戶不漏針。目前，延慶區(qū)第一次集中免疫工作已圓滿完成。據(jù)統(tǒng)計，奶牛存欄6729 頭，其中規(guī)模場13 個，存欄6543 頭，散養(yǎng)9 個村，10 戶，存欄186 頭。北京市統(tǒng)一使用的是口蹄疫O-A二價苗，延慶區(qū)應(yīng)免疫6340 頭，實際免疫6340 頭，應(yīng)免免疫密度為100%。

2 延慶區(qū)?？谔阋弑O(jiān)測狀況

科學(xué)評估免疫效果，對口蹄疫的防控有重要意義。延慶區(qū)口蹄疫抗體監(jiān)測包括集中監(jiān)測、自免場監(jiān)測、應(yīng)急監(jiān)測和跟蹤監(jiān)測。一般在免疫28 天后開展抗體監(jiān)測工作，針對不合格的場（戶）要及時分析原因，通知養(yǎng)殖場（戶）做好補免工作。目前，第一次集中免疫工作已圓滿完成，共監(jiān)測?？谔阋邩悠?310 份。

3 延慶區(qū)牛A/O型口蹄疫檢測方法

3.1 樣品的采集

采用隨機抽樣的方法，對全區(qū)13 個奶牛養(yǎng)殖場605 份血樣和10 個散養(yǎng)戶50 份血樣進行采血檢測。采血部位是頸靜脈或尾靜脈，一牛一針，要求每份血樣不少于5 mL且標(biāo)記清楚，采集完畢立即送達化驗室。規(guī)模場采樣不少于存欄量10%，散戶每戶5 份。

3.2 儀器設(shè)備

單道和多道移液器，德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀，伯樂公司。

3.3 試劑盒

口蹄疫O/A型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，蘭州獸研生物科技有限公司。

3.4 檢測方法

3. 4.1 試驗前準(zhǔn)備

從冰箱冷藏中取出試劑盒，置于室溫平衡10～30 min；配制磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST）：25 倍的PBST濃縮液用去離子水稀釋成1 倍PBST（1 份濃縮液加入24 份水進行稀釋），用于洗板和血清稀釋；口蹄疫A/O型病毒抗原配制：將試劑盒配備的口蹄疫A/O病毒凍干抗原用1 mL去離子水溶解，溶解后-20 ℃保存，使用時按照工作濃度1:55配制。

分離送檢的655 份奶牛血樣：用普通離心機分離牛血樣，將上層血清倒入深孔板中，封模后，做好標(biāo)記，4 ℃保存待用。

3.4.2 操作步驟

3.4.2.1 抗原抗體（陰陽對照血清及待檢血清）反應(yīng)

首先，進行血清稀釋。在酶標(biāo)板上，以50 μL/孔的量用PBST 2 倍連續(xù)稀釋血清，被檢血清在第1-10列從1∶4稀釋至1∶512；在第11列稀釋陽性對照血清，從1∶2稀釋至1∶256；A12-B12孔稀釋陰性對照血清，從1∶2稀釋至1∶4；E12-H12孔為病毒抗原對照孔。

其次，加病毒抗原。將病毒抗原用抗原稀釋液稀釋至工作濃度，以50 μL/孔的量加入到被檢血清、陰陽性對照血清的每一稀釋孔內(nèi)，4 孔病毒抗原對照孔僅加入100 μL/孔稀釋至工作濃度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，血清的稀釋度加倍，被檢血清從1∶8～1∶1024，由于陽性對照血清已經(jīng)預(yù)先作了8 倍稀釋，則變?yōu)?∶2～1∶4096。封板后，輕微振蕩，37 ℃溫育30 min。

3.4.2.2 用PBST連續(xù)洗板3 次，拍干，按50 μL/孔加口蹄疫A/O型酶標(biāo)抗體工作液，封板，37 ℃溫育30 min。

3.4.2.3 用PBST連續(xù)洗板3 次，拍干。將TMB底物A溶液和B溶液以1∶1比例混勻，加入混勻后的底物溶液50 μL/孔，置37 ℃顯色15 min。

3.4.2.4 顯色反應(yīng)結(jié)束后，加終止液50 μL/孔，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取D450nm值，計算結(jié)果。

3.4.3 試驗成立條件和結(jié)果判定參照試劑盒說明書。

4 結(jié)果與分析

抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計見表1。由表1可知，口蹄疫A型免疫抗體合格率為95.1%，口蹄疫O型免疫抗體合格率為93.5%，結(jié)果均超過70%，達到原農(nóng)業(yè)部的部頒標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18935—2018），表明口蹄疫O-A二價苗的免疫效果較好，延慶區(qū)奶?？傮w處于免疫保護狀態(tài)下，發(fā)生口蹄疫疫病的風(fēng)險較低。

表1 牛口蹄疫A/O型抗體ELISA結(jié)果

5 討論

全區(qū)奶?？谔阋呖贵w監(jiān)測研究表明：延慶區(qū)13 個奶牛規(guī)模養(yǎng)殖場的免疫主體責(zé)任意識較強，各自均制定了自免程序方案并能按照方案扎實開展奶?？谔阋呙庖吖ぷ?，各項操作規(guī)范化，管理水平科學(xué)化，通過監(jiān)測結(jié)果反饋出口蹄疫發(fā)生的風(fēng)險很低。

延慶區(qū)10 個養(yǎng)牛散戶中，9 個養(yǎng)殖戶兩項檢測都合格，僅有1 戶兩項檢測均不合格，該戶發(fā)生口蹄疫的風(fēng)險很大，其免疫抗體效果有待提高。動物疫病監(jiān)測機構(gòu)已將結(jié)果及時反饋給當(dāng)?shù)氐幕鶎荧F醫(yī)機構(gòu)，要求及時補免，適時開展追蹤監(jiān)測。

通過對養(yǎng)殖戶進行實地走訪發(fā)現(xiàn)防疫工作中存在兩方面問題：一是該養(yǎng)牛戶的免疫主體責(zé)任意識差，對于免疫工作和監(jiān)測工作存在抵觸心理。他們認(rèn)為只要奶牛當(dāng)下不生病，免疫就無關(guān)緊要，加之，免疫時存在過敏反應(yīng)風(fēng)險，政府對奶牛流產(chǎn)或死亡的補償資金多年來一直未變，與市場行情有一定差距，所以一旦發(fā)生過敏反應(yīng)，可能會給養(yǎng)牛戶帶來經(jīng)濟損失，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶容易產(chǎn)生拒免心理。另外，在采血監(jiān)測過程中，可能會加大奶牛應(yīng)激反應(yīng)，造成奶牛產(chǎn)奶量下降。有些防疫員采血操作不規(guī)范，會對奶牛造成傷害。加之，采樣沒有任何補貼，故養(yǎng)殖戶不能保證一牛一針；二是基層獸醫(yī)站冷鏈相關(guān)的基礎(chǔ)設(shè)施差，疫苗的儲存和運輸不符合要求，如冷藏冰箱又小又舊，防疫員用的冷藏箱使用時間過長，冷藏效果差，降低了疫苗質(zhì)量，影響了后續(xù)的使用效果。

6 防控建議

6.1 加強免疫與檔案管理

對符合免疫的牛只實行強制免疫，要求應(yīng)免免疫密度達到100%，對新補欄的牛、免疫不合格的牛要及時進行補免，建立免疫屏障，使抗體水平常年維持在較高水平，這是防止口蹄疫疫病發(fā)生最有效的手段[2]。

建立健全免疫檔案，嚴(yán)格執(zhí)行登記制度。動物免疫完成后防疫員要及時填寫《北京市動物免疫登記冊》，對病畜、臨產(chǎn)畜、新生畜、過敏畜等要嚴(yán)格執(zhí)行登記制度。存欄數(shù)據(jù)、免疫數(shù)據(jù)等基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)設(shè)專人建立和規(guī)范管理電子、紙質(zhì)雙重檔案，且必須做到填寫規(guī)范、詳細(xì)、真實、準(zhǔn)確、及時，為后續(xù)可能的溯源工作提供有力證據(jù)。

6.2 加大檢疫與監(jiān)測

動物疫病檢疫機構(gòu)要嚴(yán)格遵守檢疫制度，從源頭上遏制不明來源、未經(jīng)免疫、免疫不合格或來自疫區(qū)的奶牛流入市場。對養(yǎng)牛戶新購的奶牛要詳細(xì)、準(zhǔn)確登記備案，根據(jù)相關(guān)疫病檢測結(jié)果是否合格來出具檢疫證明，一旦出現(xiàn)弄虛作假，按照檢疫法相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。提倡養(yǎng)殖戶自繁自養(yǎng)，確需引種時，要選擇信譽高的商家，并按照當(dāng)?shù)匾?guī)定，及時報備，嚴(yán)格隔離，認(rèn)真觀察，采血檢測，待保證牛只健康后才可混群。

動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)要制定全年監(jiān)測計劃，針對重點區(qū)域要加大監(jiān)測頻次，客觀評價免疫效果，針對不合格的場（戶）及時通知基層單位進行補免，消除疫情隱患。

6.3 嚴(yán)格消毒與封閉管理

養(yǎng)殖場進行定期、嚴(yán)格的消毒，對消滅傳染源，切斷傳播途徑意義重大。每個養(yǎng)殖場需建立嚴(yán)格的消毒制度，設(shè)專人定期定時對圈舍、器械、食槽、牛體等進行消毒[3]。消毒藥品種類繁多，常用的有過氧乙酸、聚維酮碘等，為防止不同消毒劑間相互干擾，一般建議使用1～2 種。對圈舍、運動場地等環(huán)境的消毒常采用噴灑的方法，可以將奶牛驅(qū)趕到空閑處，再無死角全方位消毒，也有采用紫外照射等方法進行消毒滅源。

對奶牛場要進行封閉管理，與生活區(qū)分開，牛場外圍要設(shè)立高墻、防護網(wǎng)等。外來人員及車輛需進行消毒后，從專門通道進入牛場。免疫人員在進出場前，也要做好鞋帽及器械的消毒工作，嚴(yán)禁人為造成交叉感染。

6.4 強化宣傳與培訓(xùn)

各鄉(xiāng)鎮(zhèn)政府、各動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)、各基層機構(gòu)要采用多種方式、通過多種途徑來宣傳口蹄疫疫病的危害性，強調(diào)做好免疫工作的重要性，減輕和消除養(yǎng)殖者對疫病免疫存在的抵觸心理，使他們深刻認(rèn)識到疫病免疫的不可替代性，配合工作，積極免疫。

在免疫工作開始前，加強對包片獸醫(yī)和防疫員的技術(shù)指導(dǎo)，確保免疫質(zhì)量，對免疫結(jié)果負(fù)責(zé)。采取理論與實操相結(jié)合的方式進行培訓(xùn)，內(nèi)容主要涉及疫苗的配比與保存、注射部位選取、過敏反應(yīng)救治、血樣采集操作、冷鏈運輸管理、個人防護事項等，以此來提高基層免疫人員的專業(yè)水平，增強人身安全。免疫過程中要切實落實“消毒嚴(yán)、部位對、劑量準(zhǔn)”的操作規(guī)范，做到一牛一針，保質(zhì)保量完成免疫工作。

6.5 提升扶持力度

上級管理部門要設(shè)立專項資金，來提高基層獸醫(yī)站的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，改善辦公環(huán)境，以便順利開展各項工作；提高村級防疫員薪酬水平，調(diào)動工作積極性；提高過敏反應(yīng)補償標(biāo)準(zhǔn)，使養(yǎng)殖戶損失降低到最小。

7 結(jié)語

?？谔阋呔哂休^高的傳染性，不僅給養(yǎng)牛戶造成巨大的經(jīng)濟損失，而且對我國養(yǎng)牛業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響和不良后果。在日常飼養(yǎng)中要提高對?？谔阋咭卟〉闹匾?，要深刻反省免疫工作中的優(yōu)點和不足，保持優(yōu)點，改正不足，扎實做好口蹄疫免疫、監(jiān)測、檢疫、消毒等一系列綜合防控工作，保證奶?？谔阋咭卟×惆l(fā)生。