大黃炮制前后的化學(xué)成分變化及其減毒研究

王 敏 韓 婷 李春帥 徐文娟 楊琳琳 張姝妍 程水清 王 璇 文 佳 李向日

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制研究中心/北京市中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102488)

大黃是蓼科植物掌葉大黃(PalmatumL.)、唐古特大黃[RheumtanguticumMaxim,ex Bal(F)]或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根和根莖[1]。其藥用歷史悠久，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》?！爸飨吗鲅?，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲，宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”，列為下品。大黃臨床應(yīng)用極其廣泛，有“將軍”之稱(chēng)，目前在臨床上多用于胃腸道疾病和慢性肝病等的長(zhǎng)期治療。研究發(fā)現(xiàn)，大黃具有良好的保肝作用，可使肝臟免受纖維化、肝硬化、肝癌以及各種類(lèi)型的肝炎等的發(fā)病[2-7]。統(tǒng)計(jì)《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)、中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)、藥智網(wǎng)，得到以大黃入藥的古方7 000多首和現(xiàn)代中成藥處方700多條[8]。目前，大黃被歐洲各國(guó)、美國(guó)等許多國(guó)家所認(rèn)可，它已作為一種世界性藥物被列入19個(gè)國(guó)家的藥典[9]。

然而，有報(bào)道稱(chēng)，長(zhǎng)期服用大黃制劑可能存在肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。盡管大黃安全性引起了公眾的質(zhì)疑，但其仍是臨床肝病治療的常用藥物，因此，對(duì)大黃的肝毒性評(píng)估是必不可少的。同時(shí)，大黃生品苦寒，藥性峻烈，易損傷脾胃功能，耗損元?dú)?，?duì)于久病體弱、年老患者可選用藥性緩和的炮制品，以降低不良反應(yīng)[12]。關(guān)于大黃的炮制最早見(jiàn)于漢代張機(jī)的《金匱玉函經(jīng)》，“皆去黑皮、或炮或生，清酒洗，酒浸”[13]。傳統(tǒng)用藥常根據(jù)辨證選擇不同炮制品施治，目前大黃有多種炮制規(guī)格，其中臨床以熟大黃較為常用。

斑馬魚(yú)與人類(lèi)的基因具有87%的同源性，其基因的傳導(dǎo)通路和代謝通路與哺乳動(dòng)物也有高度的相似性[14-15]。作為一種新興模式生物，斑馬魚(yú)兼具體外細(xì)胞模型的高通量性和嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型的生物復(fù)雜性等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)基于其發(fā)育迅速、繁殖快、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[16-18]，近些年，作為一種替代模型被廣泛應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)肝毒性的評(píng)價(jià)。為了更深入地探討大黃肝毒性，本研究以不同批次的生大黃、熟大黃為研究對(duì)象，利用斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝毒性評(píng)價(jià)方法和現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)分析大黃及其炮制品的化學(xué)成分差異和毒性大小，探討大黃炮制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)內(nèi)涵，為臨床合理用藥和早期監(jiān)測(cè)、診斷病情提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 野生型斑馬魚(yú)(品系：AB品系)、轉(zhuǎn)基因型斑馬魚(yú)[品系：CZ16(gz15Tg,Tg(fabp10a：dsRed;ela3l：EGFP)]均購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，養(yǎng)殖于集中式斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(水溫28.5 ℃、光照周期為14 h光照/10 h黑暗)。

1.1.2 藥物 蘆薈大黃素對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：RFS-L01411810008)；大黃酸對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：RFS-D01002010012)；大黃素對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：PS010624)；大黃酚對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：PS011322)；大黃素甲醚對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：PS0291)；沒(méi)食子酸對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：PS000688)

1.1.3 試劑與儀器 4%多聚甲醛(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DE-0094)；磷酸緩沖鹽溶液(美國(guó)康寧公司，貨號(hào)：21-040-CVR)；干酪素(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)：S12002)；無(wú)水碳酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)：S818014)；磷鉬鎢酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，貨號(hào)：20220111)；NaCl(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1060005)、KCl(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1049003)、Na2HPO4(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1060056)、CaCl2(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1011002)、K2HPO4(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1049021)、MgSO4(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1037009)、NaHCO3(北京化工廠(chǎng)，貨號(hào)：A1060001)；吖啶橙(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S47568)；分析純甲醇(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，貨號(hào)：67-56-1)；純水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

體式熒光顯微鏡(卡爾·蔡司公司股份公司，型號(hào)：V16)；體視顯微鏡(卡爾·蔡司公司股份公司，型號(hào)：Stemi508)；光學(xué)倒置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司，型號(hào)：TE-2000-S)；微型漩渦混懸器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：WH-90A)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TGL-16M)；滅菌鍋(日本松下公司，型號(hào)：MLS-3751L)；熒光成像系統(tǒng)(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，型號(hào)：BIO-RAD ChemiDoc MP)；斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生生物科技有限公司，型號(hào)：集中養(yǎng)殖與發(fā)育系統(tǒng)設(shè)備)；細(xì)胞移液器(Eppendorf，規(guī)格：200 μL、1 mL和5 mL)；分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：SARTORIUS AG)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-600DE)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司，型號(hào)：P7雙光束型)；高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司，型號(hào)：Waters 2695)；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(北京賽普瑞斯科技有限公司，型號(hào)：250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的收集和炮制

1.2.1.1 生大黃的收集 收集7批生大黃樣品，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定，為掌葉大黃(RheumpalmatumL.)的干燥根莖。產(chǎn)地和批號(hào)信息見(jiàn)表1。

表1 生大黃樣品信息

1.2.1.2 熟大黃的炮制 本研究根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2020版)和《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》(2008版)，將7批生大黃飲片分別炮制成熟大黃，具體方法如下：取大黃片，加黃酒拌勻(100 kg大黃片用黃酒50 kg)，悶潤(rùn)1～2 h至黃酒被吸盡，裝入不銹鋼可蒸制飯盒內(nèi)，密封，蒸制24 h，此時(shí)，其表面和內(nèi)部均呈黑色，取出，晾干。

按照以上方法炮制得到的炮制品置于干燥器中，陰涼處避光保存。

飲片呈橢圓形或不規(guī)則塊片狀，直徑大小不等，外表皮黃棕色或棕褐色，有縱皺紋，切面黃棕色有明顯散在或排列成環(huán)的星點(diǎn)，有空隙；熟大黃形如生品，表面和內(nèi)部均呈黑色，質(zhì)堅(jiān)硬，氣微香。見(jiàn)圖1。

圖1 大黃炮制前后的性狀(代表性樣品)

1.2.1.3 水提物的制備 稱(chēng)取生、熟大黃飲片150 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡30 min后，煎煮30 min，過(guò)濾，藥渣中再加入8倍量的蒸餾水繼續(xù)煎煮1 h，合并水煎液，3 500 r/min，離心半徑8.7 cm,離心5 min，過(guò)濾，取上清液，濃縮，冷凍干燥后得到各生大黃及熟大黃炮制品的水提物粉末。于4 ℃冰箱保存，備用。

藥物儲(chǔ)備液的配制：精確稱(chēng)取適量大黃水提取物粉末，溶于含50 mL胚胎培養(yǎng)水的離心管中，超聲30 min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，分別配置成2 000、1 000和400 μg/mL的母液，-20 ℃冰箱中保存，在實(shí)驗(yàn)前將母液稀釋成一系列的藥物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鞣質(zhì)的含量測(cè)定

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品25.04 mg，置50 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密吸取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(49.08 μg/mL)。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取藥材粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.25 g，精密稱(chēng)定，置250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置過(guò)夜，超聲處理10 min，放冷，用水定容至刻度，搖勻，靜置，濾過(guò)，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.2.3 方法學(xué)考察

1.2.2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中(使溶液中沒(méi)食子酸含量分別為0.98 μg/mL、1.96 μg/mL、3.93 μg/mL、5.89 μg/mL、7.85 μg/mL、9.82 μg/mL)，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水11.5 mL、11.0 mL、10.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，同時(shí)制備相應(yīng)的空白對(duì)照溶液，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.2.3.2 儀器精密度實(shí)驗(yàn) 分別取沒(méi)食子酸對(duì)照溶液(49.08 μg/mL)和供試品溶液(編號(hào)：生大黃-3)，采用所確定的檢測(cè)條件，連續(xù)測(cè)定吸光度值6次。

1.2.2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(編號(hào)：生大黃-3)1.0 mL，采用所確定的檢測(cè)條件，顯色30 min后放置0、10、20、30、40、60 min，并分別測(cè)定吸光度。

1.2.2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批大黃樣品6份(編號(hào)：生大黃-3)，按1.2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按所確定的檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.3.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取同一批已知鞣質(zhì)含量的樣品6份(編號(hào)：生大黃-3，鞣質(zhì)含量為4.04%)，每份0.25 g，精密稱(chēng)定，置于250 mL容量瓶中，并精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1 mL，其酚酸含量與所取大黃樣品總酚酸含量相等，按1.2.2.2項(xiàng)制備供試品溶液，采用所確定的檢測(cè)條件，測(cè)定樣品總酚含量，計(jì)算加樣回收率。

1.2.2.4 含量測(cè)定 按1.2.2.2項(xiàng)下方法制備生、熟大黃供試品溶液，以確定的檢測(cè)條件測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.3 蒽醌的含量測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆薈大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品各2.53 mg、2.63 mg、2.43 mg、2.55 mg和2.50 mg，加甲醇分別制成1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚分別為19.84 μg、20.62 μg、19.05 μg、19.99 μg，大黃素甲醚9.80 μg的溶液，即得。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 參照《中華人民共和國(guó)藥典》大黃【含量測(cè)定】項(xiàng)下總蒽醌和游離蒽醌供試品溶液的制備[1]。

1.2.3.3 色譜條件 符合《中華人民共和國(guó)藥典》大黃含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)樣量為10 μL；流速為1.0 mL/min；柱溫為20 ℃。

1.2.3.4 含量測(cè)定 取生、熟大黃樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)，按照2.3.3項(xiàng)下方法分別制備總蒽醌和游離蒽醌供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與上述2種供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)合蒽醌含量=總蒽醌含量-游離蒽醌含量。

1.2.4 斑馬魚(yú)幼魚(yú)模型評(píng)價(jià)生、熟大黃水提物的肝毒性

1.2.4.1 斑馬魚(yú)的繁殖與飼養(yǎng) 暗周期開(kāi)始前1 d，選擇健康的成年斑馬魚(yú)按雌雄比1∶2放入具篩板的產(chǎn)卵缸內(nèi)，中間放置隔板，光周期開(kāi)始后抽去隔板，0.5 h后收集魚(yú)卵于干凈的培養(yǎng)皿中，胚胎培養(yǎng)水沖洗3遍，在顯微鏡下挑選健康的胚胎重新放入新的含胚胎培養(yǎng)水的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相同光照條件下發(fā)育至4 dpf(Days Post Feritilization，受精后天數(shù))。在3 dpf階段前，在體式顯微鏡下挑選出健康的斑馬魚(yú)幼魚(yú)。

1.2.4.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)挑選發(fā)育正常的4 dpf健康斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于12孔板的樣孔中，每孔20尾，每組設(shè)3孔重復(fù)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定空白對(duì)照組(斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)水)和不同濃度的生大黃、熟大黃組。整個(gè)暴露過(guò)程在28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。在暴露處理期間，每隔8 h統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)的斑馬魚(yú)死亡數(shù)量并及時(shí)移除死亡的幼魚(yú)。在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，于體式顯微鏡下確定不同處理存活幼魚(yú)的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)每組的死亡率。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 表型評(píng)價(jià) 選擇AB系野生型斑馬魚(yú)，在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，移除暴露液，并用胚胎培養(yǎng)水將各處理的斑馬魚(yú)幼魚(yú)沖洗3次，用三卡因溶液麻醉后，側(cè)位擺放，固定于含3%甲基纖維素的載玻片上，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)，于體式顯微鏡下觀(guān)察活體斑馬魚(yú)的肝臟變性情況，并用顯微鏡軟件(ZEN lite)拍照記錄。

1.2.4.4 肝臟病理組織學(xué)評(píng)價(jià) 選擇AB系野生型斑馬魚(yú)，在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，使用胚胎培養(yǎng)水沖洗3次，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)幼魚(yú)，轉(zhuǎn)移至含4%多聚甲醛的1.5 mL潔凈離心管中，室溫下貯存。乙醇逐步脫水，石蠟包埋，切成4～5 μm的切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，在光學(xué)倒置顯微鏡下觀(guān)察斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝組織病理學(xué)的改變，并拍照記錄。

1.2.4.5 體內(nèi)細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià) 選擇AB系野生型斑馬魚(yú)，在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，胚胎培養(yǎng)水清洗3遍，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)，在孔板中快速加入2.5 μg/mL吖啶橙溶液2 mL，于避光條件下染色30 min，使用胚胎培養(yǎng)水和磷酸緩沖鹽溶液各沖洗3遍，在熒光顯微鏡下觀(guān)察生、熟大黃對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響，并拍照記錄。

1.2.4.6 斑馬魚(yú)肝臟熒光面積的測(cè)定 選擇CZ16轉(zhuǎn)基因型斑馬魚(yú)，在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，利用熒光顯微鏡和Image J軟件統(tǒng)計(jì)不同處理組中斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟熒光面積，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 鞣質(zhì)的含量測(cè)定

2.1.1 方法學(xué)考察

2.1.1.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 計(jì)算回歸方程為Y=0.103 1X+0.034 9(R2=0.999 1，n=6)。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸濃度在0.099 4～1.274 8 μg/mL之間與其吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.1.2 儀器精密度實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分別為0.09%和1.76%，表明儀器精密度高。

2.1.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，在60 min內(nèi)溶液吸光度RSD為1.66%和1.67%，因此，樣品顯色后至少在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，鞣質(zhì)的平均含量為4.04%，RSD=2.48%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.1.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 總酚的平均加樣回收率為100.59%，RSD=1.77%，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，符合測(cè)定要求。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.2 含量測(cè)定 測(cè)得生大黃的鞣質(zhì)含量為3.59%，熟大黃的鞣質(zhì)含量為0.33%；與生大黃比較，炮制成熟大黃后鞣質(zhì)含量降低8～10倍(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 生大黃、熟大黃的鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果(%，n=2)

2.2 蒽醌的含量測(cè)定 生大黃、熟大黃飲片中總蒽醌和游離蒽醌的含量均符合現(xiàn)版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定?？傒祯⒂坞x蒽醌、結(jié)合蒽醌在生大黃中的含量分別為1.96%、1.01%和0.95%；在熟大黃中的含量分別為1.86%、1.27%和0.64%。見(jiàn)表4。與生大黃比較，熟大黃中結(jié)合蒽醌的含量降低，游離蒽醌的含量升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

表4 生大黃、熟大黃的蒽醌含量測(cè)定結(jié)果(n=2，%)

圖2 生大黃、熟大黃中游離蒽醌、結(jié)合蒽醌和鞣質(zhì)的成分含量

2.3 斑馬魚(yú)幼魚(yú)模型評(píng)價(jià)生、熟大黃水提物的肝毒性研究結(jié)果

2.3.1 急性毒性表現(xiàn)和量-毒曲線(xiàn)評(píng)價(jià) 低濃度大黃給藥時(shí)，斑馬魚(yú)幼魚(yú)略為安靜，部分幼魚(yú)伏于水底或沿壁正常游動(dòng)，未見(jiàn)明顯異常狀況；而加入高濃度大黃時(shí)，幼魚(yú)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，游動(dòng)迅速。8 h后，斑馬魚(yú)幼魚(yú)安靜伏于水底，受到外界刺激時(shí)反應(yīng)遲鈍，可觀(guān)察到幼魚(yú)的體表被染成黃色；后期可觀(guān)察到斑馬魚(yú)幼魚(yú)處于側(cè)臥狀態(tài)，用玻璃棒多次觸碰這些魚(yú)的尾部，如無(wú)反應(yīng)，則判定為死亡。在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，空白對(duì)照組的幼魚(yú)體形舒展、行動(dòng)活潑；給藥組死亡斑馬魚(yú)體態(tài)蜷曲，未死亡斑馬魚(yú)部分尾部彎曲，色素沉著降低，行動(dòng)遲緩。

結(jié)果表明，大黃的急性毒性強(qiáng)弱為：生大黃>熟大黃，熟大黃的最大非致死濃度約為生大黃的9倍，證明生大黃經(jīng)炮制后毒性顯著降低，且3批大黃的毒性下降趨勢(shì)幾乎一致。見(jiàn)圖3，表5。

圖3 生大黃、熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)死亡率的影響(n=3)

表5 生熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)的致死濃度表(μg/mL)

2.3.2 表型評(píng)價(jià) 空白對(duì)照組中斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟形態(tài)清晰，呈透明狀；生大黃組給藥后肝臟透明度降低，隨著暴露濃度的增加，肝臟區(qū)域邊緣逐漸模糊，顏色趨于灰暗狀，表明出現(xiàn)肝臟變性；熟大黃低濃度組肝臟變性程度不明顯，高濃度可見(jiàn)輕微肝臟變性。此外，還觀(guān)察到一些非肝毒性特異特征，如表面呈黃染現(xiàn)象，腸道被染紅等。見(jiàn)圖4。

圖4 生大黃、熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟表型的影響(×32，×80)

2.3.3 肝臟病理組織學(xué)評(píng)價(jià) 空白對(duì)照肝臟區(qū)域細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核呈規(guī)則圓形；生大黃低濃度可觀(guān)察到肝細(xì)胞排列不規(guī)則，組織間隙增大；高濃度組細(xì)胞核萎縮變形，肝組織排列及組織空隙嚴(yán)重程度加劇，并呈現(xiàn)空泡化，生大黃高濃度組偶見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肝組織損傷程度隨著給藥濃度的增加而加重；熟大黃低濃度組對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟組織無(wú)明顯影響，高濃度仍可見(jiàn)組織空泡化，但較生大黃組肝臟變性程度有所減輕。見(jiàn)圖5。

圖5 生大黃、熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟病理組織的影響(×10，×40)

2.3.4 體內(nèi)細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià) 與空白對(duì)照組比較，生、熟大黃給藥組對(duì)斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞凋亡的影響不同，生大黃組中斑馬魚(yú)的肝臟區(qū)域表現(xiàn)出黃綠色熒光小點(diǎn)，隨著濃度增大，凋亡細(xì)胞數(shù)量變多，說(shuō)明生大黃能夠引起顯著的肝細(xì)胞凋亡；熟大黃低濃度組未見(jiàn)凋亡，高濃度組偶見(jiàn)凋亡。見(jiàn)圖6。

圖6 生、熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟細(xì)胞凋亡的影響(×32，×80)

2.3.5 斑馬魚(yú)肝臟熒光面積的測(cè)定 與空白對(duì)照組比較，生大黃低濃度組肝臟熒光面積呈下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高濃度組的肝臟熒光面積顯著性減小(P<0.05)，熟大黃低、高濃度組肝臟熒光面積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 生大黃、熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟熒光面積的影響(n=3)

3 討論

大黃并非傳統(tǒng)的毒劇中藥，但因其生品苦寒之性峻烈，損傷脾胃功能，致使各種不良反應(yīng)發(fā)生，因此，應(yīng)對(duì)臨床用藥劑量進(jìn)行嚴(yán)格控制。自2010年起，《中華人民共和國(guó)藥典》建議大黃的用量從3～30 g/d減少到3～15 g/d，臨床應(yīng)用較為安全，然而，當(dāng)應(yīng)用于慢性病長(zhǎng)期給藥時(shí)，大黃潛在的肝毒性不容忽視。當(dāng)前對(duì)大黃的多數(shù)研究常采用單體給藥，僅關(guān)注中藥成分中的單一毒性評(píng)價(jià)，但僅憑單體的毒性表現(xiàn)并不能斷言大黃肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)必然是其中的單個(gè)成分，而與其他成分無(wú)關(guān)。本研究并不只關(guān)注某個(gè)成分，而是選擇結(jié)合蒽醌、游離蒽醌和鞣質(zhì)3類(lèi)成分，基于臨床中藥飲片炮制前后的真實(shí)生物學(xué)評(píng)價(jià)，通過(guò)化學(xué)分析結(jié)合生物學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)大黃的肝毒性進(jìn)行評(píng)估。

本研究將7批生大黃分別炮制成熟大黃，利用高效液相色譜法和紫外分光光度法對(duì)生大黃、熟大黃中的結(jié)合蒽醌、游離蒽醌和鞣質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，比較大黃炮制前后3類(lèi)成分的含量差異。結(jié)果顯示，生大黃中3種成分的含量為：鞣質(zhì)(3.59%)>游離蒽醌(1.01%)>結(jié)合蒽醌(0.95%)，而炮制成熟大黃后的含量為：游離蒽醌(1.27%)>結(jié)合蒽醌(0.64%)>鞣質(zhì)(0.33%)。炮制后鞣質(zhì)含量降低8～10倍，分析原因可能是：在炮制過(guò)程中溫度較高，鞣質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫下易被破壞，分解為單體后含量降低[13]。與生大黃比較，熟大黃的結(jié)合蒽醌含量減低，游離蒽醌含量升高，可能在雙相水解過(guò)程中導(dǎo)致結(jié)合蒽醌的水解。

同時(shí)，以4 dpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)模型對(duì)炮制前后的大黃進(jìn)行肝毒性評(píng)價(jià)，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熟大黃的最大非致死濃度顯著升高，約為生大黃的9倍，且3批大黃的毒性下降趨勢(shì)幾乎一致，表明大黃的炮制減毒作用客觀(guān)存在。然后，在低于最大非致死濃度的暴露條件下，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)表型、病理組織切片和整體吖啶橙染色來(lái)確定生、熟大黃暴露處理對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟的影響，利用斑馬魚(yú)的光學(xué)透明性和熒光轉(zhuǎn)基因特性，肝臟被確定為大黃毒性的靶器官。結(jié)果表明，與空白對(duì)照比較，生大黃能引起斑馬魚(yú)模型出現(xiàn)明顯的肝損傷，如肝區(qū)域透明度降低，肝臟萎縮、卵黃囊吸收延遲、肝臟細(xì)胞變形及凋亡；而相同濃度下的熟大黃，僅在高濃度條件下呈現(xiàn)輕微的肝臟變性。這表明經(jīng)炮制后，熟大黃對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟的毒性大大降低。以上指標(biāo)在不同條件下均表明生大黃能引起肝臟表型及組織結(jié)構(gòu)的顯著變化，引起細(xì)胞凋亡；而熟大黃的暴露處理對(duì)肝臟的損傷表現(xiàn)遠(yuǎn)輕于生大黃。

綜上所述，大黃對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟具有毒性作用，造成其不良反應(yīng)的主要成分可能為鞣質(zhì)類(lèi)成分，炮制成熟大黃后該成分的含量以及對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性和肝損傷均顯著降低。然而，其他化學(xué)成分是否也是毒性成分仍需要深入研究，關(guān)于大黃肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)以及毒理學(xué)機(jī)制，還有待大量且全面的研究來(lái)闡明，以期提高大黃臨床應(yīng)用的安全性。