宏基因組二代測(cè)序在兒童感染性疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展

劉穎梅，雷亞茹，石 瑜，張 莉，李占魁

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710000；2.西北婦女兒童醫(yī)院新生兒科，陜西 西安 710061)

感染性疾病是兒童發(fā)病率較高的疾病。兒童作為特殊群體，各器官功能發(fā)育不完善，免疫功能低下，易受各種病原體侵襲，是醫(yī)院感染高危人群，重癥感染患兒易并發(fā)休克、臟器功能衰竭而威脅生命。因此，盡早明確病原菌感染、針對(duì)性給予抗感染治療，對(duì)于減少患兒并發(fā)癥、降低病死率及改善預(yù)后有重要意義。

兒童感染性疾病的臨床病原學(xué)診斷受采樣困難、檢測(cè)方法復(fù)雜等各種因素影響。以敗血癥為例，目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍依賴于血培養(yǎng)，但其有耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、陽(yáng)性率低等特點(diǎn)，難以滿足當(dāng)今兒科感染性疾病的診療需求。同時(shí)，對(duì)于不明原因發(fā)熱的患兒，更需要快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法鑒定出病原體。此外，常規(guī)檢測(cè)方法易受抗生素的影響而造成假陰性，即便存在感染也未必全部能分離出病原微生物[1]。宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)具有無(wú)需培養(yǎng)，可直接對(duì)臨床樣本核酸進(jìn)行測(cè)序的特點(diǎn)，從而快速、精準(zhǔn)地檢測(cè)出病原體，避免了傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法的局限性[2]。目前該技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床各科室，尤其是對(duì)危重疑難感染性疾病的診治[3-5]?，F(xiàn)對(duì)宏基因組二代測(cè)序在感染性疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為兒童感染性疾病的臨床精準(zhǔn)診治提供參考依據(jù)。

1宏基因組的簡(jiǎn)介

宏基因組學(xué)亦稱為“元基因組”，它是一種誕生于21世紀(jì)初期的新興微生物檢測(cè)技術(shù)，其定義是“微生物群落中所有基因組的集合”[6]。宏基因組學(xué)研究較傳統(tǒng)的微生物研究而言，其最大的特點(diǎn)在于將微生物看成一個(gè)整體，直接對(duì)環(huán)境中所有微生物的遺傳信息進(jìn)行全面分析研究，而非依賴于對(duì)單個(gè)微生物進(jìn)行培養(yǎng)和分離，以此來(lái)提高時(shí)效性。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)及信息化時(shí)代的飛速發(fā)展，將宏基因組學(xué)技術(shù)研究又推向了新的高潮。

2 mNGS技術(shù)的發(fā)展史

研究者Sanger提出的酶法測(cè)序[7-8]及Maxam和Gilbert等提出的化學(xué)降解法測(cè)序[9]標(biāo)志著DNA測(cè)序時(shí)代的來(lái)臨。以Sanger法為代表的一代測(cè)序技術(shù)可一次性對(duì)1條DNA分子進(jìn)行測(cè)序，最長(zhǎng)能測(cè)到1 000～1 500bp，對(duì)生物學(xué)研究具有重大意義。但因該技術(shù)成本高、速度慢等局限性，并不是最佳的測(cè)序方法。隨著有關(guān)技術(shù)的不斷研發(fā)，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Soiexa技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)標(biāo)志著第二代測(cè)序技術(shù)的誕生[8]。

mNGS是繼Sanger測(cè)序后的一項(xiàng)新興技術(shù)。mNGS是一種無(wú)偏差的檢測(cè)病原體的方法，可一次性對(duì)幾百萬(wàn)條到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，因此又稱高通量測(cè)序。mNGS可分析自然界中99%尚未培養(yǎng)的微生物，直接對(duì)樣本中的DNA或RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠快速、客觀的一次性檢測(cè)出樣本中的多種病原微生物，為急危重癥和疑難感染性疾病提供了診斷依據(jù)[10-11]?？梢妋NGS在提高病原體鑒定方面具有很大潛力。

宏基因組二代測(cè)序病原體檢測(cè)包括樣本采集、核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序、生物信息分析和生成報(bào)告，檢測(cè)全流程24～72h即可完成交付。Wilson等[12]2014年在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表了人類醫(yī)學(xué)史首個(gè)利用mNGS在1名先天性免疫缺陷的14歲兒童腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)標(biāo)本中找到鉤端螺旋體特異序列，從此拉開了mNGS在臨床應(yīng)用的帷幕。

3 mNGS在兒童感染性疾病診斷中的應(yīng)用

3.1 mNGS血漿游離DNA測(cè)序檢測(cè)在兒童膿毒血癥中的應(yīng)用

膿毒血癥是一種威脅兒童生命的感染性疾病，早期診斷并及早給予抗菌藥物治療是挽救生命的關(guān)鍵，而快速的病原學(xué)診斷可以幫助臨床醫(yī)生合理的使用抗菌藥物。雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在臨床應(yīng)用越來(lái)越成熟，但該方法僅局限于病毒及部分特定細(xì)菌的檢測(cè)。2016年，Grumaz等[13]建立了一套完整的診斷工作流程，該流程基于mNGS血漿游離DNA(mcfDNA)進(jìn)行無(wú)偏差序列分析，可以鑒定傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所遺漏的潛在細(xì)菌病原體，進(jìn)而識(shí)別感染微生物。Abril等[14]報(bào)道了首次利用mNGS在重癥膿毒血癥患者的血漿中檢測(cè)出了犬鏈球菌，并通過(guò)16SrRNA測(cè)序和血培養(yǎng)再次證實(shí)了是由犬鏈球菌引起的膿毒癥感染性休克和多器官衰竭的病例。Long等[15]研究利用mNGS法和血培養(yǎng)對(duì)78例重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中的患者血液進(jìn)行分析，并通過(guò)PCR擴(kuò)增/Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示mNGS的靈敏度優(yōu)于血培養(yǎng)(30.77% vs.12.87%)，此外，mNGS還從14個(gè)標(biāo)本中檢測(cè)到15種病毒，而傳統(tǒng)培養(yǎng)未檢出，該研究表明mNGS在細(xì)菌、病毒檢測(cè)方面更具優(yōu)勢(shì)，可有效地識(shí)別多種病原體感染。Goggin等[16]在一項(xiàng)研究中評(píng)估了游離DNA測(cè)序(mcfDNA-seq)技術(shù)檢測(cè)血液系統(tǒng)腫瘤患者血漿中病原菌的敏感性和特異性，指出mcfDNA-seq可以預(yù)測(cè)75%復(fù)發(fā)性癌癥患兒中血行感染(bloodstream infaction，BSI)的病原菌，特異性超過(guò)80%，首次驗(yàn)證了基于mNGS的mcfDNA在BSI發(fā)生前識(shí)別病原體的新假設(shè)，使預(yù)防性治療成為可能。Timsit等[17]已經(jīng)將mcfDNA的mNGS檢測(cè)作為新的BSI早期診斷方法納入專家共識(shí)，肯定了血漿mcfDNA的mNGS檢測(cè)在臨床病原微生物鑒定的良好前景[18]。

3.2 mNGS在兒童下呼吸道感染性疾病中的應(yīng)用

呼吸道感染性疾病嚴(yán)重威脅兒童健康，造成了重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，病原體的早期識(shí)別和鑒定對(duì)于精準(zhǔn)治療至關(guān)重要。Wang等[19]對(duì)32例重癥肺炎患兒的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)樣本，使用傳統(tǒng)檢測(cè)方法和mNGS進(jìn)一步鑒定病原體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在全部32例BALF中，mNGS鑒定出包括腺病毒、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、巨細(xì)胞病毒和博卡病毒等；而在15例BALF樣本中，傳統(tǒng)檢測(cè)法未發(fā)現(xiàn)常見病原體，表明mNGS可以提高患兒重癥肺炎病原體檢測(cè)的敏感性。Lin等[20]報(bào)道了1例經(jīng)血漿mNGS診斷患兒嗜麥芽窄食單胞菌重癥肺炎的案例，該患兒入院后行常規(guī)檢查均為陰性，考慮患兒年齡小、病情重，不適合采集BALF樣本，對(duì)其血液進(jìn)行了mNGS檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌為血液唯一細(xì)菌病原體，此外還發(fā)現(xiàn)幾種真菌。mNGS在新型冠狀病毒(COVID-19)肺炎疫情診斷中也發(fā)揮了重要作用。Ren等[21]利用mNGS技術(shù)，在5名重癥肺炎患者的BALF中鑒定出了以前未知的冠狀病毒，并通過(guò)Sanger測(cè)序確認(rèn)了其基因組序列，最終證實(shí)COVID-19起源于蝙蝠。隨后，Wu等[22]利用mNGS對(duì)死于COVID-19患者的肺和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組及蛋白組進(jìn)行了分析，并對(duì)患者肺中嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)的宿主反應(yīng)進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)患者的死亡可能與宿主反應(yīng)有關(guān)，而不是病毒感染爆發(fā)引起的，揭示了COVID-19的病理生理學(xué)，并為重癥COVID-19疾病提供了潛在的治療靶標(biāo)。因此，對(duì)于不明原因的下呼吸道感染，mNGS將提高對(duì)兒科“未知”病原體的診斷率，可協(xié)助對(duì)新型病原體的鑒定。

3.3 mNGS在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷中的應(yīng)用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是一種威脅兒童生命的常見神經(jīng)科疾病，早期診斷困難，一旦發(fā)展到重癥腦膜炎預(yù)后較差，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥。因此，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷方法和積極的抗生素治療對(duì)改善其預(yù)后至關(guān)重要。Zhang等[23]在一項(xiàng)回顧性研究中首次分析了mNGS對(duì)腦膜炎患兒感染肺炎鏈球菌的診斷價(jià)值，在135例患者CSF標(biāo)本中經(jīng)mNGS鑒定出肺炎鏈球菌32例，利用臨床微生物檢測(cè)法(培養(yǎng)法或肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)法)和PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示在病例26中通過(guò)培養(yǎng)法檢測(cè)到肺炎鏈球菌，而PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性；在病例28中通過(guò)培養(yǎng)法檢測(cè)到金黃色葡萄球菌，而PCR并未檢測(cè)出病原菌，表明mNGS的靈敏度高于PCR。2020年潘春熹等研究表明，在使用抗生素后mNGS對(duì)病原體檢測(cè)較傳統(tǒng)方法有較高的靈敏度。Wang等[24]報(bào)道了1例用mNGS在患兒CSF樣本中鑒定出罕見的解脲脲原體的病例，并通過(guò)PCR進(jìn)一步證實(shí)，患兒得到迅速及時(shí)診斷，紅霉素治療4周后治愈，臨床隨訪未見后遺癥。因此，mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷中的應(yīng)用具有重要價(jià)值。

4 mNGS應(yīng)用于感染性疾病中存在的問(wèn)題

4.1定植和感染的區(qū)分

對(duì)于呼吸道感染，mNGS在病毒及罕見病原體中具有較好的檢測(cè)效能，但在細(xì)菌、真菌的檢測(cè)中，尚不能準(zhǔn)確判斷菌群定植或感染狀態(tài)，需要結(jié)合臨床具體分析。近年來(lái)，臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已開發(fā)出可將真正病原菌與培養(yǎng)皿中的定居者分開的程序，并且正在為mNGS開發(fā)類似方法[25]。另一種方法是監(jiān)測(cè)和評(píng)估宿主的免疫反應(yīng)[26]。這些方法可能需要進(jìn)一步研究，以確定區(qū)分定植和感染的最佳方法。

4.2有關(guān)數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和分析及數(shù)據(jù)庫(kù)

mNGS在疾病診斷中的主要難題是能夠?qū)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為與臨床相關(guān)的信息。在儲(chǔ)存和分析方面，mNGS生成的大量數(shù)據(jù)繁重，其中包括對(duì)主機(jī)的讀取，可能涉及到患者的隱私問(wèn)題。此外，需要快速的生物信息學(xué)工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以獲得可用于臨床的結(jié)果。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室需要人工智能來(lái)補(bǔ)充生物學(xué)信息專業(yè)知識(shí)，有研究者建議使用K-聚物、標(biāo)記和對(duì)比進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確保最高靈敏度和特異性[27]。最后，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中部分序列包含錯(cuò)誤信息，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，因此需不斷更新數(shù)據(jù)。

4.3 mNGS報(bào)告的正確解讀

對(duì)于臨床醫(yī)生而言，最大的挑戰(zhàn)也許是對(duì)mNGS結(jié)果的解釋，當(dāng)前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不能單純只看檢測(cè)值，還應(yīng)結(jié)合參考值及感染灶進(jìn)行綜合分析，否則容易誤判。為解決這個(gè)問(wèn)題，一些機(jī)構(gòu)建立了由醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、生物信息學(xué)、傳染病專家及其它臨床小組組成的醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)，其可在出報(bào)告前進(jìn)行討論，并提供對(duì)mNGS結(jié)果的解讀，這樣可確保解讀的報(bào)告與臨床數(shù)據(jù)是相關(guān)的。

5展望

綜上所述，mNGS作為一種新興的病原微生物診斷技術(shù)，尚不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的診斷方法，但對(duì)于常規(guī)方法無(wú)法診斷的重癥感染患兒，可作為一種補(bǔ)充手段來(lái)識(shí)別病原體。目前，mNGS技術(shù)在成人的應(yīng)用中已經(jīng)得到了專家的肯定，并被納入了“宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)在中重癥感染中的臨床應(yīng)用專家共識(shí)(第1版)(李穎等2020年)”“中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識(shí)”及有關(guān)文獻(xiàn)[17]，期待更多的臨床研究來(lái)推廣mNGS在兒童重癥感染性疾病中的應(yīng)用。