禽白血病檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

張振興，薛曉巖，2，胡 騎，季 佳，2，王 斌，宋建領(lǐng)

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；3.威信縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南威信 657900）

禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（avian leucosis virus，ALV）引起的一種呈世界性分布的禽類(lèi)重要免疫抑制性疾病[1-2]。ALV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科α 反轉(zhuǎn)錄病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈線(xiàn)性RNA 病毒[3-4]。ALV 可造成感染雞群對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制而降低抗感染的能力，產(chǎn)生腫瘤、生產(chǎn)性能下降甚至死亡等多種危害[5-6]；人工感染情況下，對(duì)鴿、鵪鶉、鷓鴣等也可引起腫瘤病變，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[7]。

我國(guó)在1999 年從國(guó)外引進(jìn)的白羽肉雞中首次發(fā)現(xiàn)ALV，隨后在蛋雞、地方品種雞以及野鳥(niǎo)中也發(fā)現(xiàn)了病毒感染[8-9]。ALV 感染雞引起的死亡率可達(dá)20%以上，給我國(guó)養(yǎng)雞行業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)的ALV 凈化工作起步較晚，至2013 年基本控制了AL 疫情發(fā)生，但2015 年后ALV 又在我國(guó)地方品種雞中流行[8]。

AL 嚴(yán)重威脅我國(guó)家禽種質(zhì)資源安全，2021 年被我國(guó)列為《國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃（2021—2025 年）》中需要防范的主要禽病之一。針對(duì)AL 防控，至今仍未發(fā)現(xiàn)任何有效藥物和疫苗，目前最主要的手段是通過(guò)不斷凈化，切斷外源性感染途徑，以控制ALV 傳播。雖然可以通過(guò)臨床解剖、病雞病理學(xué)觀(guān)察及流行病學(xué)調(diào)查等對(duì)AL 進(jìn)行初步診斷，但因其臨床癥狀與馬立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）等引起的疫病癥狀有相似之處[10]，容易被誤判，延誤疫情防控，所以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是必不可少的環(huán)節(jié)，而準(zhǔn)確高效的檢測(cè)技術(shù)對(duì)開(kāi)展AL 流行病學(xué)調(diào)查和凈化具有重要意義[11]。目前，世界各國(guó)已經(jīng)建立了多種ALV 檢測(cè)和凈化方法，包括病原學(xué)檢測(cè)、病理學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等。

1 病原學(xué)檢測(cè)

病原學(xué)檢測(cè)主要是病毒分離鑒定。將感染動(dòng)物的糞便、精液、血液、組織（脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、肝臟等）處理后接種ALV 敏感細(xì)胞來(lái)分離病毒。最常用的分離培養(yǎng)細(xì)胞是DF-1 細(xì)胞或CEF 細(xì)胞，一般在細(xì)胞中培養(yǎng)5～7 d，連續(xù)培養(yǎng)3 代后分離病毒。病毒分離后用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、中和試驗(yàn)（NT）等方法，對(duì)分離毒株進(jìn)行鑒定和亞群區(qū)分。病毒分離鑒定是診斷AL 的金標(biāo)準(zhǔn)，但其對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)成本高，培養(yǎng)過(guò)程容易受外界污染，因而難以在基層推廣應(yīng)用。為了提高ALV 分離效果，科研工作者做了許多優(yōu)化和改善。例如：對(duì)含有ALV 的雞血漿分離血清時(shí)，用抗凝血靜置法替代傳統(tǒng)離心法[2]；加入雞血漿改進(jìn)培養(yǎng)液替代常規(guī)培養(yǎng)，以便更有利于DF-1 細(xì)胞的維持和生長(zhǎng)[2]；對(duì)CEF 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行重新定義，解決無(wú)法排除內(nèi)源性ALV 干擾問(wèn)題[10]；將維持液成分中的胎牛血清替換為驢血清，以有利于ALV 培養(yǎng)[12]。

2 病理學(xué)檢測(cè)

2.1 病理組織切片

運(yùn)用病理組織切片技術(shù)進(jìn)行雞群ALV 感染篩查。通常選取雞群中已經(jīng)產(chǎn)生明顯腫瘤病變的組織，進(jìn)行常規(guī)制片和蘇木精-伊紅染色，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察病變組織的病理形態(tài)。該方法只能確定組織是否產(chǎn)生了腫瘤病變，但很難確定是否由ALV 引起。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，如果病變組織切片胞漿中含有大量圓球形嗜酸性顆粒的骨髓細(xì)胞瘤性病變，那么就可以基本斷定該雞群感染了J 亞群ALV[13-14]，或許這對(duì)其他亞群ALV 的鑒定帶來(lái)一定的參考價(jià)值。病理組織切片觀(guān)察需要具備一定的經(jīng)驗(yàn)，初學(xué)者容易做出誤判。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，病理組織切片技術(shù)的使用越來(lái)越少。

2.2 免疫組化技術(shù)

免疫組化技術(shù)是通過(guò)標(biāo)記ALV 特有抗原或與ALV 相結(jié)合的特異性抗體，對(duì)組織內(nèi)分布的抗體或抗原進(jìn)行原位檢測(cè)的技術(shù)。張玲娟等[15]曾將組織芯片技術(shù)和免疫組化染色技術(shù)相結(jié)合，選取J 亞群ALV 囊膜蛋白gp85 的單克隆抗體檢測(cè)發(fā)病雞肝臟、脾臟、腎臟等組織切片的ALV 陽(yáng)性抗原。雖然該種方法檢測(cè)ALV 的準(zhǔn)確率較高，但是近幾年很少有通過(guò)免疫組化技術(shù)進(jìn)行ALV 檢測(cè)的研究。這可能是因?yàn)榭乖砦蛔R(shí)別需要特異性抗體，而針對(duì)不同亞群ALV 就需要設(shè)計(jì)合成不同的特異性抗體，成本較高，操作繁瑣。雖然無(wú)法改進(jìn)特異性抗體制備工藝，但是可以進(jìn)一步優(yōu)化免疫組化檢測(cè)技術(shù)中的抗原修復(fù)時(shí)間、單抗稀釋比例、DAB 染色時(shí)間等多個(gè)步驟[16-17]，使其更有利于AL 的鑒別診斷。該方法雖然能夠?qū)乖M(jìn)行定位，但操作過(guò)程比較復(fù)雜，且影響試驗(yàn)結(jié)果因素較多，因此主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究，而基層推廣應(yīng)用較少。

2.3 間接免疫熒光檢測(cè)（IFA）

IFA 是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行熒光色素標(biāo)記，通過(guò)觀(guān)察抗原和抗體結(jié)合后是否產(chǎn)生熒光反應(yīng)來(lái)進(jìn)行病毒篩查。該檢測(cè)技術(shù)建立時(shí)間較早，1998 年Smith 等[18]就提出了檢測(cè)ALV 特異性抗原的熒光抗體檢測(cè)方法，但其局限性也很多。例如：運(yùn)用此種方法進(jìn)行ALV 檢測(cè)必須具備熒光顯微鏡、ALV 各亞群特異性單克隆抗體等；可能會(huì)出現(xiàn)非特異性熒光，對(duì)ALV 的檢測(cè)篩查產(chǎn)生主觀(guān)誤導(dǎo)。秦愛(ài)建等[19]對(duì)J 亞群的ALV變異株進(jìn)行IFA 檢測(cè)時(shí)就產(chǎn)生了很多非特異性熒光；以DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)的ALV 作為抗原，通過(guò)IFA進(jìn)行雞血清抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)操作較為復(fù)雜[20]。以上局限性制約了該方法的推廣應(yīng)用。

3 血清學(xué)檢測(cè)

3.1 中和試驗(yàn)

傳統(tǒng)NT 技術(shù)是一種可以檢驗(yàn)ALV 抗體或抗原且敏感度較高的技術(shù)。秦愛(ài)建等[21]用自研單抗做NT檢測(cè)，再用ELISA對(duì)ALV復(fù)制情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果基本相符，證明制備的特異性單抗可以中和ALV。傳統(tǒng)NT 技術(shù)敏感度較高，可以進(jìn)行大批量疑似ALV 感染雞群檢測(cè)，但由于其對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高、操作繁瑣、所需時(shí)間較長(zhǎng)等原因，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中很少用于AL 篩查和診斷。為克服傳統(tǒng)NT 技術(shù)的缺點(diǎn)，很多科研學(xué)者不斷運(yùn)用新技術(shù)，嘗試對(duì)NT 技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)：以假病毒為基礎(chǔ)的NT 技術(shù)，不僅可以檢測(cè)抗體滴度，還可以進(jìn)行高通量測(cè)定[22]；創(chuàng)建mRNA 轉(zhuǎn)錄抑制法，解決空斑減少中和試驗(yàn)的檢測(cè)周期長(zhǎng)、敏感性低等問(wèn)題，使其更加靈敏、快速、精確[23]；以改造工程細(xì)胞為基礎(chǔ)的中和抗體檢測(cè)方法，可以大大減少多種病毒的前期改造工作，使其能夠快速應(yīng)用于新發(fā)傳染病研究[23]。NT 技術(shù)雖然仍有不足，但是隨著新技術(shù)的不斷研發(fā)，其在ALV 檢測(cè)中重要性也會(huì)重新體現(xiàn)。

3.2 ELISA

ELISA 方法可用于血清、細(xì)胞培養(yǎng)液、胎糞等材料的ALV 檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外針對(duì)ALV 設(shè)計(jì)的ELISA 檢測(cè)試劑盒主要檢測(cè)ALV 的p27 抗原，其優(yōu)勢(shì)在于省時(shí)省力、樣品所需用量少，可以對(duì)大批量樣品進(jìn)行檢測(cè)，不需要大量的儀器設(shè)備，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外眾多種雞培育公司、養(yǎng)雞場(chǎng)的主要ALV檢測(cè)方法。但是p27 抗原高度保守，無(wú)法區(qū)分外源性和內(nèi)源性ALV[24]，還需要對(duì)ALV 陽(yáng)性樣品env基因（或gp85基因）進(jìn)行測(cè)序才能劃分ALV 亞群。另外，ELISA 試劑盒以其設(shè)定的S/P值為判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)“假陽(yáng)性”或“假陰性”的誤判；即使達(dá)到陽(yáng)性S/P值判定標(biāo)準(zhǔn)，也只能證明樣品曾經(jīng)感染過(guò)ALV，因而會(huì)造成一定數(shù)量的“誤殺”損失。因此，提高操作人員ELISA 檢測(cè)熟練度[25]，有針對(duì)性的選擇靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的ELISA 檢測(cè)試劑盒，對(duì)于減少誤差，加快場(chǎng)內(nèi)ALV 凈化起著至關(guān)重要的作用[20]。

3.3 膠體金免疫層析

膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，通過(guò)標(biāo)記與ALV 相應(yīng)的特異性抗原或抗體，使待檢樣品中相應(yīng)的抗體或抗原在載體的T 線(xiàn)或C線(xiàn)發(fā)生特異性免疫顯色反應(yīng)的一種檢測(cè)方法[26]，其優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)。胡衛(wèi)國(guó)[27]利用ALV-A 單抗作為示蹤標(biāo)志物，以ALV-A 多抗作為T(mén) 線(xiàn)抗體，成功建立了一種ALV-A 膠體金免疫層析檢測(cè)方法，相比于PCR 檢測(cè)技術(shù)，其假陽(yáng)性率更低；趙巍[28]研制了一種ALV-J 血清抗體膠體金試紙條，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)效果與ELISA 相符，并且能檢測(cè)到更低濃度的高免血清。由此可見(jiàn)，雖然膠體金免疫層析技術(shù)在我國(guó)獸醫(yī)領(lǐng)域起步較晚，但由于其顯著的優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)和作用[29-30]。

4 分子生物學(xué)檢測(cè)

4.1 RT-PCR

RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)通過(guò)提取樣品特異性核酸，結(jié)合微量RNA 進(jìn)行ALV 檢測(cè)。宋建領(lǐng)等[31]針對(duì)ALVgp85基因設(shè)計(jì)合成1 對(duì)引物，對(duì)感染ALV 病雞的組織樣品提取核酸進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高，目的條帶清晰，無(wú)雜帶。但是RT-PCR 方法對(duì)樣品病毒含量無(wú)法定量，而且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物需要電泳觀(guān)察等，已逐漸被熒光定量PCR 技術(shù)代替。

4.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR 檢測(cè)方法以設(shè)計(jì)指定的ALV 熒光探針和特定引物為核心，對(duì)ALV 進(jìn)行快速檢測(cè)和定量，是一種檢測(cè)靈敏度高、易于操作、自動(dòng)化程度高的省時(shí)省力的檢測(cè)方法。嚴(yán)立福等[32]以ALV 分離株（FGD1803）基因組為模板，構(gòu)建重組質(zhì)粒建立了SYBR Green I 熒光定量PCR 方法；SYBR Green I 染料可以與任何dsDNA 結(jié)合，無(wú)需設(shè)計(jì)和優(yōu)化探針，有效提高了定量PCR 的檢測(cè)效率，同時(shí)該染料穩(wěn)定性高，不容易失活；王萌[33]以ALV 陽(yáng)性病料gag基因相對(duì)保守區(qū)域作為檢測(cè)目的片段，建立了SYBR Green I 熒光定量PCR 方法，使得結(jié)果更可靠準(zhǔn)確。這些均說(shuō)明ALV 熒光定量PCR 檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好[34]，因此被廣泛應(yīng)用。

4.3 數(shù)字PCR（ddPCR）

ddPCR 作為一種新型生物檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)、病原體定性等多個(gè)領(lǐng)域當(dāng)中，其原理是對(duì)樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增前先進(jìn)行微滴化處理，通過(guò)對(duì)PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行微滴判讀，來(lái)確定檢測(cè)樣品為陽(yáng)性或陰性。其優(yōu)點(diǎn)在于不需要依賴(lài)Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)核酸定量，對(duì)核酸濃度要求低，對(duì)特殊樣品有一定的高耐受性，檢測(cè)費(fèi)用低廉[35-36]。但是ddPCR 檢測(cè)儀器較為精密，對(duì)檢測(cè)人員操作要求高，基因倒位或大片段缺失會(huì)影響檢測(cè)準(zhǔn)確性，因而限制了其適用范圍[37-38]。

4.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）

LAMP 檢測(cè)技術(shù)從問(wèn)世到現(xiàn)在已有20 多年，無(wú)論是檢測(cè)原理、所需引物設(shè)計(jì)還是反應(yīng)產(chǎn)物判定均已逐漸成熟化、標(biāo)準(zhǔn)化，成為基層檢測(cè)人員使用的主要檢測(cè)手段之一。相比于RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)，LAMP 檢測(cè)技術(shù)不需要對(duì)各階段反應(yīng)溫度進(jìn)行繁瑣設(shè)定，全過(guò)程在同一溫度設(shè)定條件下即可完成。不僅如此，這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)還大大降低了對(duì)各種設(shè)備儀器的要求，反應(yīng)時(shí)間也比RT-PCR 縮短了一半以上。近幾年，Peng 等[39]根據(jù)ALV 中的pol基因，設(shè)計(jì)合成4 對(duì)特異性引物，建立了可檢測(cè)A、B、E、J 等亞群ALV 的LAMP 檢測(cè)方法；張民秀等[40]設(shè)計(jì)的ALV LAMP 檢測(cè)方法不僅能對(duì)ALV 感染進(jìn)行快速診斷，還可以對(duì)ALV、雞傳染性貧血病毒（CIAV）的混合感染提供技術(shù)支持。

4.5 高敏熒光微球檢測(cè)

高敏熒光微球檢測(cè)方法是根據(jù)時(shí)間分辨熒光免疫層析原理設(shè)計(jì)的一種應(yīng)用于ALV 檢測(cè)的新型檢測(cè)方法，其通過(guò)儀器讀取反應(yīng)后免疫復(fù)合物中的熒光微球發(fā)光值，測(cè)算ALV p27 抗原數(shù)值，從而進(jìn)一步判定是否感染ALV[41-42]。此種方法操作簡(jiǎn)便，可適用于大批量樣品的快速定量檢測(cè)，與膠體金試紙條檢測(cè)方法一樣，可作為基層使用的快速診斷檢測(cè)技術(shù)[43-44]。

5 結(jié)語(yǔ)

不同的ALV 檢測(cè)技術(shù)各有其優(yōu)點(diǎn)和不足。隨著新技術(shù)的發(fā)展和完善，各種應(yīng)用于ALV 檢測(cè)的技術(shù)得到了不斷優(yōu)化、改進(jìn)和發(fā)展。充分了解現(xiàn)在已有的ALV 檢測(cè)方法，并在日常檢測(cè)中根據(jù)各檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)和自身實(shí)際情況進(jìn)行綜合考量、選擇，或?qū)Σ煌瑱z測(cè)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化組合，可以提高ALV 檢出率，縮短凈化時(shí)間，提高工作效率。