免疫細(xì)胞單細(xì)胞測序?qū)δ[瘤免疫治療療效預(yù)測的意義

王琦綜述；蔣敬庭審閱(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院 腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，蘇州大學(xué)細(xì)胞治療研究院，江蘇 常州 213003)

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）及嵌合 抗原受體修飾 T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞的基礎(chǔ)及臨床轉(zhuǎn)化研究是腫瘤研究的熱點之一。ICI治療在多種類型腫瘤中觀察到持續(xù)的應(yīng)答和顯著的生存優(yōu)勢，但部分患者并未受益[1-2]。CAR-T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤中取得了顯著療效[3]，但由于在多種實體瘤中的療效欠佳[4]，其臨床應(yīng)用仍受到一定的阻礙。如何對免疫治療療效進(jìn)行有效的預(yù)測，是亟待解決的問題之一。目前用于預(yù)測ICI治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物主要包括PD-L1的表達(dá)、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤突變負(fù)荷、T細(xì)胞炎性基因表達(dá)譜[5]、腸道微生物群的特定特征[6]等，但在多種類型腫瘤中的預(yù)測效果不統(tǒng)一，且整體的預(yù)測有效率較低。單細(xì)胞測序技術(shù)，是在單個細(xì)胞水平上對基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測序分析的一項新技術(shù)。利用單細(xì)胞測序技術(shù)揭示腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的異質(zhì)性，對尋找有效的抗腫瘤免疫治療療效預(yù)測指標(biāo)具有重要的價值。本文就近年來單細(xì)胞測序獲得的免疫細(xì)胞亞群狀態(tài)作為免疫治療療效預(yù)測的生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為尋找有效的抗腫瘤免疫治療療效預(yù)測指標(biāo)提供新的思路。

1 CD8+T細(xì)胞

目前基于單細(xì)胞測序技術(shù)的研究結(jié)果[7]顯示，TME中的免疫細(xì)胞具有顯著差異。T細(xì)胞在抗腫瘤免疫治療中起重要作用，其中，CD8+T細(xì)胞的增殖與ICI治療應(yīng)答相關(guān)。因此，CD8+T細(xì)胞在腫瘤監(jiān)測、編輯及控制過程中發(fā)揮重要作用。

1.1 組織浸潤CD8+T細(xì)胞

在一項針對接受PD-1單抗帕博利珠單抗（pembrolizumab）或納武單抗（nivolumab）治療晚期黑色素瘤的研究[8]中，發(fā)現(xiàn)40例患者腫瘤組織中高表達(dá)PD-1和CTLA-4（PD-1hiCTLA-4hi）的浸潤性CD8+T細(xì)胞的比例增加，與治療應(yīng)答和無進(jìn)展生存期（PFS）密切相關(guān)，并且這部分CD8+T細(xì)胞具有耗竭性T細(xì)胞的表型。耗竭性腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞的相對豐度預(yù)示著對抗PD-1治療的應(yīng)答，可用于篩選對治療有較高臨床應(yīng)答的患者。

通過對ICI治療的黑色素瘤患者48個腫瘤組織樣本中的16 291個免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）分析，根據(jù)CD8+T細(xì)胞的狀態(tài)分為兩個亞群：高表達(dá)與記憶、激活及細(xì)胞存活等相關(guān)基因（IL-7R、TCF7、REL、FOXP1、FOSL2和STAT4）并且低表達(dá)共刺激相關(guān)分子的CD8_G亞群，高表達(dá)耗竭相關(guān)基因（CD38、HAVCR2、ENTPD1、PDCD1、BATF、LAG3、CTLA4和PTPN6）的CD8_B亞群。在對治療有應(yīng)答的患者中，CD8_G/CD8_B比例＞1。并且發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TCF7+CD8+T細(xì)胞的比例可以預(yù)測患者的應(yīng)答率以及提示更好的預(yù)后結(jié)果[9]。

對接受抗PD-1治療黑色素瘤患者的研究[10]發(fā)現(xiàn)，利用33例腫瘤組織的scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析了CD8+T細(xì)胞浸潤程度及促進(jìn)免疫逃逸的腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)，設(shè)定了一種腫瘤細(xì)胞表達(dá)的免疫抵抗性程序，該程序與T細(xì)胞的排除和免疫逃逸相關(guān)。這種免疫抵抗性程序在ICI治療之前就已表達(dá)，是原位“冷”TME的一個特征。并且在112例黑色素瘤患者的隊列研究中驗證了在ICI治療前這種免疫抵抗性程序能用來預(yù)測患者對抗PD-1治療的臨床療效。

有研究[11]通過結(jié)合scRNA-seq及單細(xì)胞TCR測序（single cell TCR sequencing，scTCR-seq）技術(shù)，追蹤基底細(xì)胞癌或鱗狀細(xì)胞癌患者抗PD-1治療前后腫瘤組織的TCR克隆及轉(zhuǎn)錄表型，發(fā)現(xiàn)其克隆性增殖的CD8+CD39+T細(xì)胞共表達(dá)慢性T細(xì)胞活化和耗竭的標(biāo)志分子。然而，在這種情況下，克隆性增殖的T細(xì)胞克隆不是來自預(yù)先存在的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，而是來自同一腫瘤中之前未觀察到的新的克隆型?；颊邔筆D-1治療的應(yīng)答依賴于腫瘤招募新的T細(xì)胞克隆取代先前存在的耗竭T細(xì)胞的內(nèi)在能力，CD8+CD39+T細(xì)胞或許在未來可以成為預(yù)測患者免疫治療效果的有效指標(biāo)。由于腫瘤組織取樣較為困難，如果選擇更容易獲取的外周血樣本，則具有更好的可操作性。

1.2 外周血CD8+T細(xì)胞

在一項針對接受帕博利珠單抗治療的Ⅳ期黑色素瘤患者的單細(xì)胞測序研究[12]中，通過獲得其治療前后的外周血免疫細(xì)胞圖譜，從而確定了外周血循環(huán)耗竭性CD8+T細(xì)胞的藥效動力學(xué)變化。另外，對ICI治療無應(yīng)答的患者，不僅僅是由于無法誘導(dǎo)免疫重塑，還與T細(xì)胞恢復(fù)和腫瘤負(fù)荷之間的不平衡相關(guān)。通過驗證隊列證實，患者外周血循環(huán)Ki67+PD-1+CD8+T（腫瘤特異性）細(xì)胞比例與基線水平處腫瘤負(fù)荷的比值越高，提示患者有較好的臨床療效。

在接受抗PD-1治療的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中，也觀察到類似的結(jié)果[13]。在免疫治療后，約70%的患者Ki-67+PD-1+CD8+T細(xì)胞增加，且這些增殖的CD8+T細(xì)胞具有效應(yīng)樣表型（HLA-DR+、CD38+和 Bcl2lo），表達(dá)共刺激分子（CD28、CD27和ICOS），并具有高水平的PD-1和CTLA-4共表達(dá)。并且80%對免疫治療應(yīng)答的患者都出現(xiàn)了PD-1+CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，而70%的疾病進(jìn)展患者存在延遲或缺失的PD-1+CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，提示PD-1+CD8+T細(xì)胞具有重要的預(yù)測意義。

收集接受抗PD-1/PD-L1治療的Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者治療前后的外周血樣本，流式細(xì)胞術(shù)分離PD-1+CD8+T細(xì)胞的TCRβ鏈的CDR3區(qū)進(jìn)行scTCR-seq。治療前PD-1+CD8+TCR多樣性高的患者具有更好的應(yīng)答及PFS，治療后PD-1+CD8+TCR克隆性增加的患者具有更長的PFS[14]。因此，外周血PD-1+CD8+T細(xì)胞TCR的多樣性和克隆性可作為NSCLC患者對ICI治療應(yīng)答的重要標(biāo)志物。

2 CD4+T細(xì)胞

抗PD-1治療對經(jīng)典霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin lymphoma，cHL）非常有效，cHL患者的9p24.1染色體上的 CD274（PD-L1）和 PDC1LG2（PD-L2）基因經(jīng)常出現(xiàn)拷貝數(shù)增加。但在cHL這種MHCⅠ陰性的腫瘤中，抗PD-1治療的作用機制仍未明確。通過scTCR-seq檢測CheckMate 205Ⅱ期臨床試驗（NCT02181738）[15]治療的56例抗PD-1治療應(yīng)答cHL患者對的外周血免疫細(xì)胞特征。治療前，TCR受體庫多樣性高的患者及在治療期間有TCR克隆擴增的患者療效最佳。在治療過程中，CD4+T細(xì)胞的受體庫多樣性增加，在獲得完全緩解的患者中尤為顯著，說明個體免疫微環(huán)境很大程度上影響ICI治療的療效。

另外，針對接受抗PD-1治療的NSCLC患者[16]，利用scRNA-seq及scTCR-seq技術(shù)鑒定了單個外周血T細(xì)胞克隆，并監(jiān)測了它們在免疫治療期間的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著高于CD8+T細(xì)胞，且隨著疾病進(jìn)展，外周血效應(yīng)T細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)CD4+T細(xì)胞比例迅速降低，提示其具有作為預(yù)測標(biāo)志物的潛力。

在接受抗PD-1/抗CTLA-4治療的黑色素瘤患者[17]中，表達(dá)PD-1的CD4+FOXP3-T細(xì)胞（4PD-1hi）是一種非傳統(tǒng)型的抑制性T細(xì)胞，4PD-1hi在腫瘤內(nèi)的積累會增加腫瘤負(fù)荷?？笴TLA-4治療會引起瘤內(nèi)和外周血4PD-1hi數(shù)量的增加，并呈劑量依賴性。但抗CTLA-4聯(lián)合抗PD-1治療可以減少這個效應(yīng)并提高抗腫瘤的活性。4PD-1hi細(xì)胞亞群是治療應(yīng)答的不良預(yù)后因素。

目前，依托單細(xì)胞技術(shù)的CD4+T細(xì)胞的免疫治療研究較少，但其在腫瘤免疫中的重要角色會隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用而不斷被挖掘出來，并在預(yù)測免疫治療療效方面發(fā)揮不可忽視的作用。

3 B細(xì)胞

臨床前研究[18]表明，新輔助ICI治療與輔助治療相比，可提高自發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌小鼠模型的OS率和抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在一項新輔助ICI治療（納武單抗vs納武單抗+伊匹單抗）高風(fēng)險可切除的黑色素瘤的隨機Ⅱ期臨床試驗（NCT02519322）[19]中，聯(lián)合治療的實際有效率高達(dá)45%，比單藥的實際有效率25%提高了80%，治療效果得到了大幅度提升，患者OS延長。相對于治療無應(yīng)答的患者，B細(xì)胞信號在對治療有應(yīng)答的患者中富集。同樣是依托NCT02519322隨機Ⅱ期臨床試驗的一項研究[20]發(fā)現(xiàn)，接受新輔助ICI治療的黑色素瘤的應(yīng)答者CD20+B細(xì)胞和三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structure，TLS）的密度以及TLS與腫瘤面積的比值均高于無應(yīng)答者，尤其在治療早期獲得的腫瘤標(biāo)本中，這樣的現(xiàn)象更為明顯，也說明治療早期腫瘤組織中的免疫細(xì)胞浸潤狀態(tài)的預(yù)測價值高于治療前的腫瘤組織。應(yīng)答患者存在顯著的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈克隆性及B細(xì)胞受體（B-cell receptor，BCR）多樣性增加，表明B細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的活躍性。與T細(xì)胞和其他免疫標(biāo)志物相比，B細(xì)胞相關(guān)基因（MZB1、JCHAIN和IGLL5）在應(yīng)答患者中高表達(dá)，有望改變B細(xì)胞功能的基因標(biāo)志（FCRL5、IDO1、IFNG和BTLA）在應(yīng)答患者中富集。在單變量分析中，僅B細(xì)胞的信號就能預(yù)測患者有無應(yīng)答，當(dāng)納入其他免疫細(xì)胞浸潤的成分進(jìn)行多變量分析時，表明B細(xì)胞不是單獨發(fā)揮作用，可能與其他免疫細(xì)胞亞群協(xié)同作用。

在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者臨床樣本中對B細(xì)胞抗腫瘤應(yīng)答的研究[21]發(fā)現(xiàn)，OS率的提高與腫瘤相關(guān)CD8+T細(xì)胞和CD20+B細(xì)胞的同時存在有關(guān)，而與其他臨床特征無關(guān)。對TLS形成的分子標(biāo)志物CXCR5、CXCL13及CD20進(jìn)行免疫熒光染色，顯示TLS在CD8+T細(xì)胞和CD20+B細(xì)胞同時存在的腫瘤內(nèi)形成。隨后通過scRNA-seq獲取富含TLS的黑色素瘤的相關(guān)基因特征，包括已知的B細(xì)胞特異表達(dá)基因CD79B，在活化的B細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的基因CCR6，還有其他類型免疫細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)基因等，可預(yù)測患者在接受ICI治療后的結(jié)局。富含B細(xì)胞的腫瘤伴有TCF7+幼稚T細(xì)胞和/或記憶性T細(xì)胞的增加，表明富含B細(xì)胞的TLS在黑色素瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

軟組織肉瘤（soft-tissue sarcoma，STS）代表一類包括50多種組織學(xué)亞型的腫瘤，不同亞型患者的臨床表現(xiàn)往往不典型，對ICI等療法的應(yīng)答差異很大。通過對608例STS標(biāo)本進(jìn)行基因表達(dá)譜分析[22]，根據(jù)TME的不同分為五種肉瘤免疫表型（sarcoma immune classes，SIC）：免疫低（A和B）、免疫高（D和E）以及血管高度形成（C）組。E組的特征是存在豐富的包含T細(xì)胞和濾泡DC的TLS及B細(xì)胞。SIC和B細(xì)胞可以預(yù)測STS患者的OS，即使在不同CD8+T細(xì)胞及細(xì)胞毒性的背景下[表達(dá)PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）或FOXP3]，B細(xì)胞仍是最主要的預(yù)后因素。

4 髓系細(xì)胞

腫瘤浸潤髓系細(xì)胞是TME中最主要的抗原提呈細(xì)胞，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及免疫治療過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要包括巨噬細(xì)胞、DC、多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）和單核細(xì)胞。

髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是由多種具有抑制功能的細(xì)胞構(gòu)成的群體，主要分為粒細(xì)胞樣MDSC（G-MDSC）、單核細(xì)胞樣 MDSC（M-MDSC）、多形核 MDSC（PMN-MDSC）等類型，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素。在接受伊匹單抗治療前的黑色素瘤患者外周血中，低水平的M-MDSC預(yù)示較長的OS[23]；在接受H3.3K27M特異性腫瘤疫苗治療后的彌漫性中線膠質(zhì)瘤（diffuse midline glioma，DMG）患者外周血中低水平的MDSC預(yù)示較長的OS[24]；在接受抗PD-1治療的NSCLC患者外周血中，較高水平的調(diào)節(jié)性T（regulatory T,Treg）細(xì)胞和較低水平的PMN-MDSC或M-MDSC預(yù)示較長的OS[25]；另外一項研究[26]中，接受抗PD-1治療的NSCLC患者外周血中，無應(yīng)答患者M(jìn)DSC的擴增和募集顯著高于應(yīng)答患者，其中，無應(yīng)答患者Lox-1+PMNMDSC數(shù)量在抗PD-1治療后增加，說明Lox-1+PMNMDSC可能是NSCLC患者中免疫抑制MDSC，是預(yù)測治療無應(yīng)答的潛在標(biāo)志物。

通過scRNA-seq在多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[27]中觀察到了一組獨特的巨噬細(xì)胞亞群，表達(dá)高水平的CD73，能夠在抗PD-1治療后持續(xù)存在。CD73hi髓系細(xì)胞高表達(dá)免疫抑制基因以及趨化因子/趨化因子受體基因（CCR5、CCR2、ITGAV/ITGB5和CSF1R）誘導(dǎo)GMB的免疫抑制。高表達(dá)CD73hi髓系細(xì)胞信號特征的患者比低表達(dá)患者具有較短的OS。

此前，已有諸多研究報道血漿IL-8升高與ICI治療的不良結(jié)果相關(guān)[28]。分析接受抗PD-L1阿特珠單抗（atezolizumab）治療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌和轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌[29]患者血漿IL-8水平及外周血單個核細(xì)胞IL-8基因的表達(dá)情況，血漿、外周血單個核細(xì)胞、腫瘤組織中高水平的IL-8與療效不佳相關(guān)。scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，無應(yīng)答患者與應(yīng)答患者相比，髓系細(xì)胞表達(dá)更高水平的IL-8，且IL-8的高表達(dá)與抗原呈遞機制的下調(diào)相關(guān)。因此逆轉(zhuǎn)IL-8介導(dǎo)的髓系炎癥應(yīng)答，或可改善接受ICI治療的患者預(yù)后?；趩渭?xì)胞技術(shù)逐漸完善髓系細(xì)胞特征圖譜，將獲得更有價值的聯(lián)合治療靶點及預(yù)測標(biāo)志物。

綜上，不同類型的免疫細(xì)胞作為免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物的臨床意義見表1。

5 CAR-T細(xì)胞

CAR-T細(xì)胞療法對血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者有顯著療效，但輸注后CAR-T細(xì)胞的命運并不完全清楚。CAR-T細(xì)胞被輸入到患者體內(nèi)后，將暴露在一個動態(tài)的TME中，但TME和不斷變化的腫瘤負(fù)荷如何隨輸入時間影響CAR-T細(xì)胞的狀態(tài)，還未得到很好的研究。利用TCR測序、整合位點分析和scRNA-seq技術(shù)分析輸注制品和輸注后患者血液中的CD8+CAR-T細(xì)胞的克隆和基因表達(dá)特征[30]。研究對象為Ⅰ期臨床試驗（NCT01865617）中接受CD19-CAR-T細(xì)胞治療的復(fù)發(fā)難治性急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）或慢性淋巴細(xì)胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者。在治療的早、中期，有氧代謝和細(xì)胞毒性標(biāo)志物基因的表達(dá)增加。但在治療的后期，隨著腫瘤清除后，靶抗原減少，有氧代謝和細(xì)胞毒性標(biāo)記基因的表達(dá)降低，抑制性受體基因的表達(dá)增加。通過分析輸注制品和輸注后患者血液中CAR-T細(xì)胞的TCR克隆成分，可以追蹤到單個CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征如何影響輸注后的命運，并且輸注制品中CD27+CD8+T比例與CLL患者的臨床療效相關(guān)。

B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）CAR-T細(xì)胞在復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者中顯示出良好的療效。在漿細(xì)胞白血病中，通過scRNA-seq分析BCMA-4-1BBz CAR-T細(xì)胞在輸注前、高峰或緩解期的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞在發(fā)育過程中從高度增殖轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨燃?xì)胞毒性，并且CD19-CAR-T和BCMA-CART細(xì)胞具有相似的轉(zhuǎn)錄特征，尤其是細(xì)胞輸注后在體內(nèi)的高峰期。因此，利用單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)能解析患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的增殖及克隆狀態(tài)，并輔助臨床醫(yī)生制定更加合理的治療策略。

推進(jìn)CAR-T細(xì)胞療法進(jìn)展的一個重要目標(biāo)是確定臨床療效的預(yù)測指標(biāo)。目前，CAR-T細(xì)胞是用患者自身的T細(xì)胞產(chǎn)生的“個性化”產(chǎn)品，質(zhì)量不統(tǒng)一且可變性大。對NHL患者輸注前的CD19-CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行功能及scRNA-seq分析[31]，細(xì)胞產(chǎn)品的多功能性由兩個方面來評估：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞因子的分泌；包括穩(wěn)態(tài)/增殖、炎癥、趨化、調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)5個方面的32個關(guān)鍵免疫相關(guān)分子的表達(dá)情況構(gòu)成的多功能強度指數(shù)。發(fā)現(xiàn)多功能強度指數(shù)與患者的臨床應(yīng)答顯著相關(guān)。另一項基于CD19-CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于復(fù)發(fā)/難治性CD19+白血病的Ⅰ期臨床試驗（NCT02028455）的研究[32]發(fā)現(xiàn)，輸注前外周血LAG-3+/TNF-αlowCD8+T細(xì)胞頻率增加以及耗竭標(biāo)志物的表達(dá)與初始治療失敗相關(guān)。

scRNA-seq分析一組接受CD19-CAR-T細(xì)胞治療的大B細(xì)胞淋巴瘤患者的輸注制品[33]。在完全應(yīng)答者中觀察到CD8+中央記憶T細(xì)胞的特征，而在部分應(yīng)答者中觀察到CD8+T細(xì)胞功能障礙特征，并富含耗竭和激活標(biāo)記以及編碼MHCⅡ類蛋白的基因，表達(dá)CCR7+CD27+CD8+T細(xì)胞的富集與完全應(yīng)答者相關(guān)，揭示了特定T細(xì)胞亞群與不同的臨床結(jié)果相關(guān)。CD19-CAR-T治療引起免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS），患者最初出現(xiàn)震顫、書寫困難、輕度表達(dá)性失語、失用和注意力受損的這種不良反應(yīng)與ICANS相關(guān)細(xì)胞密切相關(guān)。因此，在輸注制品中檢測ICANS相關(guān)細(xì)胞可以預(yù)測患者是否處于神經(jīng)毒性的高危狀態(tài)，并使用針對髓系細(xì)胞功能的藥物（如IL-1受體拮抗劑）進(jìn)行預(yù)防性治療。此外，通過從應(yīng)答和無應(yīng)答白血病患者提取的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq檢測[34]，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中受損的死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致CD19-CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒殺傷功能失效并驅(qū)動CD19-CAR-T細(xì)胞功能障礙，提示了一種與抗原無關(guān)的CAR-T細(xì)胞治療耐藥的新機制。因此，利用單細(xì)胞測序技術(shù)識別CAR-T細(xì)胞在治療過程中的轉(zhuǎn)錄組特征，可發(fā)現(xiàn)預(yù)測臨床應(yīng)答的標(biāo)志物，在個性化免疫治療中發(fā)揮作用。

6 結(jié)語

綜上所述，機體的免疫系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而腫瘤具有異質(zhì)性，單一和通用的預(yù)測標(biāo)記可能不現(xiàn)實。CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞等免疫細(xì)胞有望作為免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物之一，但仍需結(jié)合其他分子標(biāo)志物以及臨床預(yù)后因素建立一個綜合預(yù)測模型，進(jìn)而可能為合理構(gòu)建和評估基于抗PD-1和/或PD-L1的組合治療方案提供更為精準(zhǔn)的提示。雖然近年來測序成本持續(xù)下降，單細(xì)胞技術(shù)呈飛躍式發(fā)展，但如果要廣泛應(yīng)用于腫瘤患者的個體化免疫治療中，仍存在以下缺點：（1）樣本采集有難度，外周血樣本是最容易獲取的，但如果需要更具代表性的腫瘤組織作為樣本，是否能獲取到足夠數(shù)量及質(zhì)量的細(xì)胞，仍然具有不確定因素；（2）工作流程耗時長，因為使用的樣本材料數(shù)量很少，但分析仍然需要足夠的細(xì)胞數(shù)量以確保所有細(xì)胞類型都能得到標(biāo)示，且需要創(chuàng)建簡化和優(yōu)化的工作流程以縮短完成測序所需的時間；（3）數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，很多由學(xué)者研發(fā)的分析數(shù)據(jù)軟件大部分都是開源的，但只有小部分既掌握先進(jìn)生物信息學(xué)和統(tǒng)計技能，同時具備生物學(xué)系統(tǒng)知識的研究人員才能獲取權(quán)威結(jié)果，且目前關(guān)于如何定義質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、去除技術(shù)偽像和解釋結(jié)果的指導(dǎo)方針有限；（4）費用昂貴，成本較高及所需的大多數(shù)儀器和試劑都很昂貴，導(dǎo)致患者家庭經(jīng)濟壓力較大。相信隨著單細(xì)胞多組學(xué)研究的不斷深入、基因測序成本的進(jìn)一步降低，基于單細(xì)胞水平的測序、蛋白分析極具發(fā)展?jié)摿?，將為人們認(rèn)識疾病、理解其免疫機制及新藥物研發(fā)提供新的視角與方案。