1,2,4-三氯苯對斑馬魚及其胚胎發(fā)育的影響研究

辛建珍

（清遠市清環(huán)檢測技術有限公司，廣東 清遠 511500）

1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）是一種具有高沸點的有機物，被廣泛應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料等產(chǎn)業(yè)[1]，目前已在環(huán)境中廣泛檢出[2]。該物質對人體具有較強的致癌、致畸、致突變作用[3]。常年產(chǎn)卵的斑馬魚個體?。w長4～5 cm），飼養(yǎng)方便簡單，產(chǎn)卵量大且易于收集，其早期發(fā)育階段對外界環(huán)境敏感，是毒性試驗的常用模式生物。直接暴露于1,2,4-TCB 中的成年斑馬魚容易受到損傷，對其胚胎進行染毒能夠避免對其母體的傷害，能更直觀地觀察到胚胎的發(fā)育毒性效應。本試驗主要研究不同濃度的1,2,4-TCB對斑馬魚的毒性效應，并通過卵凝結、孵化率和畸形率等毒理學終點指標觀察其對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。

1 試驗方法與材料

1.1 受試生物與試劑

采用反應靈敏、外觀正常、體態(tài)均勻（體長3.25 cm±0.35 cm）的健康成年斑馬魚作為受試對象。斑馬魚購于廣州市芳村市場，置于室內水族箱中進行馴養(yǎng)，馴養(yǎng)7 d 后試驗，試驗前一天斷食。主要試劑有1,2,4-TCB 和丙酮（分析純），所用試劑均為市售有證合格試劑。

1.2 測試終點及指標

目前，斑馬魚及其胚胎染毒時間主要集中在4～48 h，可以觀察的毒理學終點包括卵凝結、囊胚發(fā)育、外包活動階段、原腸胚終止、胚孔關閉、體節(jié)數(shù)、尾部延伸、20 s 內主動活動、眼點發(fā)育、心跳、血液循環(huán)、黑色素細胞、耳石的發(fā)育，48 h 后（不超過72 h）主要觀察心率、孵化率和畸形率等。其間主要涉及Ⅰ類、Ⅱ類兩類指標，代表致死性的Ⅰ類指標包括卵凝結、不開始原腸胚作用、原腸胚作用不終止、無體節(jié)、尾部無延伸、無心跳、48 h 后無主動運動、不孵化等，揭示化合物特定作用方式（非致死性指標）的Ⅱ類指標包括體節(jié)數(shù)顯著減少、無血液循環(huán)、眼點不發(fā)育、24 h 后無主動運動、各種畸形、孵化延遲等。

1.3 試驗方法

定量1,2,4-TCB 用丙酮助溶后（丙酮的體積分數(shù)不超過1%）[4]，用雙蒸水配制成濃度1 000 mg/L 的儲備液備用，使用時稀釋到所需濃度。

1.3.1 斑馬魚毒性試驗

采用半靜態(tài)試驗法，急性毒性試驗按照資料[5-6]所述方法進行。試驗用水為曝氣48 h 后的自來水，試驗器皿為規(guī)格25 cm×18 cm×25 cm 的小水族缸。量取2 L 藥液置于每個水族缸中，根據(jù)等對數(shù)間距設計5 個濃度組（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L）[7]，同時做1 個對照組、1 個助溶劑組和1個平行組。每個組別放入10 尾受試斑馬魚。隨時撈出死亡受試魚，試驗期間不可喂食斑馬魚，每3 d 更換一次水，試驗周期為9 d，每天觀察一次，并記錄致死率，觀察其中毒癥狀。應用概率單位法計算，得到暴露各時間的半致死濃度（LC50）及其95%置信區(qū)間[8]。

1.3.2 斑馬魚胚胎體外染毒

以3 ∶2 的雌雄比例，將產(chǎn)卵期的斑馬魚放在孵化器中，待其產(chǎn)卵。撈出魚卵，用去離子水沖洗魚卵3次，然后用顯微鏡分辨受精卵、未受精卵，選取正常分裂受精卵。為了與斑馬魚毒性試驗對比，設置一致的濃度梯度組（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L）、對照組、平行組，另設一助溶劑組（1,2,4-TCB 濃度20 mg/L，丙酮體積分數(shù)0.8%）。用潔凈培養(yǎng)皿作為斑馬魚胚胎體外染毒試驗容器，每組培養(yǎng)皿中放入20 mL 試液，并放入20 枚約孵化3 h的囊胚期受精卵，置于室溫下培養(yǎng)。從斑馬魚產(chǎn)卵開始計時，每4 h 記錄一次情況，并記錄發(fā)育過程中的毒理學終點[9-11]。

1.3.3 斑馬魚胚胎體內染毒

將之前處理9 d 后所剩的斑馬魚撈出并放置于清水中。由于高濃度（15 mg/L、20 mg/L）組處理的斑馬魚全部死亡，剩下3 個濃度組（1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）和1 個對照組的斑馬魚。待剩下的3 個濃度組斑馬魚產(chǎn)卵，撈出魚卵，用去離子水沖洗3次，用顯微鏡區(qū)分受精卵與未受精卵，選取正常分裂的受精卵。每組有20 枚受精卵，室溫培養(yǎng)，做兩組。從魚產(chǎn)卵時開始計時，每4 h 觀察一次，并記錄發(fā)育過程中的毒理學終點[12-14]。

2 結果與討論

2.1 斑馬魚急性毒性試驗

試驗濃度量的丙酮對斑馬魚沒有影響，但是斑馬魚對1,2,4-TCB 的毒性表現(xiàn)非常敏感，在高濃度時，魚立即表現(xiàn)出中毒癥狀，如煩躁、亂竄、局促不安、劇烈運動、跳動、側游，而后運動速度逐漸減慢[15-16]。96 h后，10 mg/L 處理組的魚游動漸緩，呼吸越發(fā)急促，碰觸時魚反應遲鈍，經(jīng)常浮上水面呼吸。15 mg/L 與20 mg/L 處理組出現(xiàn)魚死亡。96 h 后換水，受試魚開始幾分鐘會出現(xiàn)一些煩躁不安的中毒癥狀，后續(xù)平靜下來。沒發(fā)現(xiàn)死亡情況，原因可能是已經(jīng)適應環(huán)境。

染毒96 h后，1,2,4-TCB 與斑馬魚致死率的劑量效應關系曲線如圖1 所示。將濃度換成濃度對數(shù)，將致死率換成概率單位，得到1,2,4-TCB 概率單位與對數(shù)濃度的曲線方程y=4.821 4x-0.449 5，相關系數(shù)r=0.852 8，概率P＜0.001，二者呈現(xiàn)良好的線性關系。由概率單位法可得，染毒96 h 后斑馬魚LC50為3.94 mg/L，95%置信區(qū)間為3.14～4.74 mg/L。

圖1 染毒96 h 后1,2,4-TCB 與斑馬魚致死率的劑量效應關系曲線

2.2 斑馬魚胚胎體外染毒試驗

本研究將72 h 時孵化不出來的胚胎作為卵凝結一起統(tǒng)計。與對照組相比，經(jīng)1,2,4-TCB 處理后的斑馬魚胚胎產(chǎn)生各種毒理學終點，主要有卵凝結、原腸胚向外凸、尾短無延伸、心包囊水腫、孵化延遲或不孵化等。卵凝結導致胚胎停止發(fā)育，趨于死亡或者已死亡。當1,2,4-TCB 濃度為0 mg/L時，斑馬魚胚胎未出現(xiàn)致死效應。隨著試劑濃度升高，斑馬魚胚胎致死率升高。在同一濃度，隨著受試時間的增加，卵凝結的比例增大。由此得知，斑馬魚胚胎體外染毒試驗存在一定的時間效應與劑量效應。

2.3 斑馬魚胚胎體內染毒試驗

用1,2,4-TCB 處理斑馬魚，不僅對其生長有一定影響，也對其產(chǎn)卵數(shù)量及其正常受精有一定影響。1 mg/L 處理組的斑馬魚卵影響不明顯，隨著濃度的升高，影響逐漸增大，10 mg/L 處理組的斑馬魚未受精卵約占一半。采用不同濃度的1,2,4-TCB 對斑馬魚處理9 d，之后觀察其產(chǎn)的魚卵，試驗發(fā)現(xiàn)，卵凝結效應明顯，且具有較高的致死率，隨著濃度的增加，斑馬魚卵凝結增加。對于同一濃度處理過的斑馬魚，隨著時間的延長，其卵凝結比例增大。對比可知，1,2,4-TCB 對斑馬魚胚胎體外染毒的毒性效應要比體內染毒明顯。

3 結論

本試驗采用1,2,4-TCB 對斑馬魚及其魚卵進行處理。斑馬魚急性毒性試驗顯示，1,2,4-TCB 對斑馬魚的毒性具有明顯的劑量效應，當濃度大于10 mg/L時，中毒癥狀明顯。1,2,4-TCB 能致斑馬魚胚胎卵凝結、尾部延伸少、脊椎彎曲、畸形及致死率上升。1,2,4-TCB 對斑馬魚胚胎發(fā)育具有明顯的致畸作用，相比體內染毒，體外染毒對斑馬魚胚胎影響更明顯，主要表現(xiàn)在致畸方面。1,2,4-TCB 對生態(tài)環(huán)境具有潛在危害，本試驗數(shù)據(jù)可為其生態(tài)風險評估提供依據(jù)。