多殺菌素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵工藝研究

和富明，田杰偉，劉文林，楊傳倫，劉海玉，陳振發(fā)

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.京博農(nóng)化科技有限公司，山東 濱州 256500）

多殺菌素(spinosad)是一種由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)通過(guò)好氧發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。多殺菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，不但具有生物農(nóng)藥的安全性、環(huán)境友好性，還具有化學(xué)合成農(nóng)藥的速效性，其作用模式獨(dú)特、自然分解快，是一種應(yīng)用前景廣闊的新型生物農(nóng)藥[1-2]。多殺菌素也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效和安全的殺蟲(chóng)抗生素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上和糧食儲(chǔ)藏中均具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景[3-5]。

目前，國(guó)內(nèi)齊魯制藥有限公司、浙江拜克生物科技有限公司、河北威遠(yuǎn)生物化工有限公司等6家公司于2015—2019年取得了多殺菌素的農(nóng)藥登記證書(shū)，但是僅有齊魯制藥有限公司于2020年8月在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市阿榮旗正式投入生產(chǎn)。原因是生產(chǎn)工藝還不成熟，受菌種產(chǎn)素能力不高、發(fā)酵水平較低等因素限制，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍然面臨著生產(chǎn)技術(shù)和成本的雙重難題[6-7]。

因此，如何提高產(chǎn)量依然是多殺菌素的研究重點(diǎn)。提高多殺菌素的產(chǎn)量主要從以下兩方面開(kāi)展工作：一是改變菌株自身的遺傳性狀。陳園等[8]以NTG（亞硝基胍）為誘變劑對(duì)刺糖多孢菌進(jìn)行誘變，最終在誘變劑量2 mg·mL-1、處理時(shí)間50 min時(shí)獲得產(chǎn)量提高43.96%的多殺菌素高產(chǎn)株；鄔洋等[9]開(kāi)展的10×MIC濃度的巴龍霉素抗性篩選研究中，抗性突變株的產(chǎn)量是原始菌株的2.2倍；黨福軍等[10]建立了刺糖多孢菌的基因敲除技術(shù)（即去除spnK編碼保守區(qū)域序列），在工業(yè)菌株中構(gòu)建了spnK失活的突變株，可以大量產(chǎn)生多殺菌素J和L；王海霞[11]通過(guò)等離子體誘變結(jié)合氯霉素、利福平、鏈霉素和慶大霉素抗生素組合進(jìn)行多重抗性篩選，獲得了1株高產(chǎn)菌株14-2，其多殺菌素發(fā)酵單位比誘變前提高了28.68%。二是通過(guò)外部條件的改變調(diào)控發(fā)酵過(guò)程。何思穎等[12]通過(guò)對(duì)11種常見(jiàn)碳源進(jìn)行代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)以5 g·L-1的甘露糖作為碳源添加時(shí)，顯著提高丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量1.78倍；鄒球龍等[13]通過(guò)pH值調(diào)控補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素，其產(chǎn)量可達(dá)1.050 μg·mL-1，提高了82%。同時(shí)研究人員嘗試添加油脂類(lèi)、氨基酸類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)成分來(lái)滿(mǎn)足刺糖多孢菌的生長(zhǎng)需求，使得產(chǎn)生菌在原有發(fā)酵水平上有了較大幅度提高[14-18]。

本研究先利用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，然后選擇單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高多殺菌素產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多殺菌素生產(chǎn)菌株Saccharopolyspora spinosa YJY-12，由黃河三角洲京博化工研究院有限公司精化材料生物研究所生物育種實(shí)驗(yàn)室篩選、保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖7 g·L-1，飴糖10 g·L-1，酪蛋白胨3 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，MgSO42 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，消前pH值6.9～7.3，121℃滅菌20 min；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，飴糖10 g·L-1，酵母浸粉20 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，黃豆餅粉15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，MgSO44 g·L-1，消前pH值6.9～7.3，121℃滅菌20 min；

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖45 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯30 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉10 g·L-1，玉米漿干粉10 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，(NH4)2SO43 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，(NH4)6Mo7O240.002 g·L-1，F(xiàn)eSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 mL·L-1，CaCO35 g·L-1，加水定容至相應(yīng)體積，滅菌前pH值調(diào)至7.3～7.5，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 從-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接種至固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)8 d，活化菌種，形成孢子。

1.2.2 種子液培養(yǎng) 取活化后的平板，刮下孢子，制備孢子懸液，孢子懸液按1%～3%(V/V)的接種量接種至種子瓶培養(yǎng)基，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)至種子液呈土黃色，獲取搖瓶種子液。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵 將搖瓶中的種子液按照一定比例接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)至240 h，取樣進(jìn)行多殺菌素含量檢測(cè)。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 前期通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組成，現(xiàn)通過(guò)軟件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L18(37)（如表1所示），對(duì)培養(yǎng)基中的各組成含量進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)定

1.2.5 種齡優(yōu)化 分別將培養(yǎng)3～8 d的刺糖多孢菌種子液按照10%的比例接種至裝有基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，pH值6.5，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)至240 h，取樣進(jìn)行多殺菌素含量檢測(cè)。

1.2.6 接種量?jī)?yōu)化 將培養(yǎng)3 d的刺糖多孢菌種子液分別按照1%、5%、10%、15%的比例接種至裝有基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，pH值6.5，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)至240 h，取樣進(jìn)行多殺菌素含量檢測(cè)。

1.2.7 發(fā)酵溫度優(yōu)化 將培養(yǎng)3 d的刺糖多孢菌種子液按照10%的比例接種至裝有基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，pH值6.5，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，溫度分別為26、28、30、32℃，培養(yǎng)至240 h，取樣進(jìn)行多殺菌素含量檢測(cè)。

1.2.8 發(fā)酵pH值優(yōu)化 將培養(yǎng)3 d的刺糖多孢菌種子液按照10%的比例接種至裝有基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，溫度30℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)至240 h，取樣進(jìn)行多殺菌素含量檢測(cè)。

1.2.9 多殺菌素提取及含量檢測(cè) 取發(fā)酵液1 mL，加無(wú)水乙腈4 mL，充分振蕩30 min，10 000 g離心10 min，取上清液，通過(guò)HPLC測(cè)定多殺菌素的發(fā)酵水平。

液相條件：C18反相柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)，流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（0.05%乙酸銨水溶液）＝45∶45∶10；流速1.0 mL·min-1，波長(zhǎng)250 nm，溫度35℃。

1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，設(shè)為試驗(yàn)組，接種刺糖多孢菌，應(yīng)用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)；同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，將刺糖多孢菌接種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，同等條件下進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)至240 h，分別取樣進(jìn)行多殺菌素含量檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，運(yùn)用Origin軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

本研究利用正交設(shè)計(jì)助手設(shè)計(jì)了七因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分的含量進(jìn)行優(yōu)化，以多殺菌素含量為響應(yīng)值確定最適培養(yǎng)基配方，試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。

表2為試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析，表3為試驗(yàn)結(jié)果的方差分析，從不同因素所對(duì)應(yīng)的極差值可以看出，因素A（葡萄糖）對(duì)多殺菌素含量影響最大，其次為C（油酸甲酯），其余因素從大到小依次為G（(NH4)2SO4）、F（蛋白粉）、B（棉籽蛋白）、D（酵母粉）、E（玉米漿干粉）。試驗(yàn)得出優(yōu)化后的培養(yǎng)基組合為葡萄糖55 g·L-1、棉籽蛋白30 g·L-1、油酸甲酯40 g·L-1、酵母粉10 g·L-1、玉米漿干粉5 g·L-1、蛋白粉15 g·L-1、(NH4)2SO41 g·L-1，發(fā)酵后的多殺菌素含量最高可達(dá)2.155 g·L-1。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)直觀分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.2 種齡優(yōu)化

在抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵中，種齡會(huì)對(duì)發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。種齡過(guò)高，雖然菌絲量會(huì)增加，但種子培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗竭而使菌絲逐漸趨于老化，影響接種后其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的活力，最終會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物含量的降低。種齡過(guò)低，菌絲量太少，同樣會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)量。

刺糖多孢菌種齡對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖1所示，刺糖多孢菌種子液培養(yǎng)至第4天時(shí)，多殺菌素產(chǎn)量最高，為2.231 g·L-1。種齡3 d的多殺菌素含量為1.356 g·L-1，這說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，種子液中的菌體量逐漸提高，且活力較高，接種后能在發(fā)酵培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)，縮短延滯期。種齡大于4 d后，多殺菌素產(chǎn)量逐漸降低，尤其是在第8天，多殺菌素產(chǎn)量?jī)H為0.893 g·L-1，此時(shí)菌體衰老較為嚴(yán)重，影響次級(jí)代謝的酶活力，進(jìn)而引起發(fā)酵異常，不利于抗生素的生物合成。

圖1 種齡對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.3 接種量?jī)?yōu)化

微生物的初始細(xì)胞濃度會(huì)影響微生物繁殖的啟動(dòng)時(shí)間，較大的接種量有利于微生物快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而較小的接種量將會(huì)延長(zhǎng)微生物生長(zhǎng)的延滯期，繁殖啟動(dòng)較晚，進(jìn)而影響產(chǎn)物的合成。

刺糖多孢菌接種量對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖2所示，當(dāng)接種量為5%時(shí)，多殺菌素產(chǎn)量最高為2.023 g·L-1。刺糖多孢菌初始接種量過(guò)高，菌絲過(guò)早生長(zhǎng)，消耗培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分，影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的生長(zhǎng)，不利于多殺菌素的合成。接種量過(guò)低，則會(huì)引起發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)緩慢，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵異常等。

圖2 接種量對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.4 發(fā)酵溫度優(yōu)化

微生物的生長(zhǎng)和抗生素的合成等代謝活動(dòng)都是在各種酶的催化下進(jìn)行，而酶的催化作用需要有適宜的溫度。從酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)來(lái)說(shuō)，隨著溫度的升高，酶的活性加強(qiáng)，反應(yīng)速率加快，生長(zhǎng)代謝加快，抗生素分泌期提前，但溫度過(guò)高，則會(huì)影響酶的活性，菌體迅速衰老，發(fā)酵周期縮短，抗生素含量降低。因此維持微生物的生長(zhǎng)和抗生素的合成所需要的最適溫度是提高抗生素發(fā)酵水平的重要條件[19]。

溫度對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖3所示，刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)多殺菌素的最適溫度為28℃，多殺菌素產(chǎn)量為2.224 g·L-1。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.5 發(fā)酵pH值優(yōu)化

pH值對(duì)刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)多殺菌素的影響如圖4所示，pH值在6.0～7.0之間時(shí)隨著pH值的增加，多殺菌素含量逐漸提高，并在pH值7.0時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，為2.145 g·L-1，繼續(xù)提高pH值，多殺菌菌素含量略有降低，說(shuō)明刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)多殺菌素的最適pH值為7.0。

圖4 pH值對(duì)多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方：葡萄糖55 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯40 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉15 g·L-1，玉米漿干粉5 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，（NH4)2SO41 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，(NH)6Mo7O240.002 g·L-1，F(xiàn)eSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 mL·L-1，CaCO35 g·L-1，加水定容至相應(yīng)體積，滅菌前pH值調(diào)至7.3～7.5，121℃滅菌20 min。

優(yōu)化后的培養(yǎng)條件：刺糖多孢菌種齡4 d，接種量10%，搖床溫度28℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1，培養(yǎng)240 h。

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行刺糖多孢菌的培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行多殺菌素含量測(cè)定。如表4所示，對(duì)照組多殺菌素含量為1.823 g·L-1，試驗(yàn)組多殺菌素含量為2.625 g·L-1，優(yōu)化后多殺菌素含量提高了43.99%。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究將本實(shí)驗(yàn)室保存的刺糖多孢菌YJY-12用于發(fā)酵產(chǎn)多殺菌素的優(yōu)化試驗(yàn)，首先通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的培養(yǎng)基組成，并得到各組分對(duì)多殺菌素合成的影響效果，從大到小依次為葡萄糖＞油酸甲酯＞（NH4)2SO4＞蛋白粉＞棉籽蛋白＞酵母粉＞玉米漿干粉。通過(guò)試驗(yàn)對(duì)刺糖多孢菌發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最適刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)多殺菌素的條件為種齡4 d，接種量5%，溫度28℃，pH值7.0。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)比較了對(duì)照組與優(yōu)化后的試驗(yàn)組的多殺菌素含量，研究結(jié)果顯示，對(duì)照組多殺菌素含量為1.823 g·L-1，試驗(yàn)組多殺菌素含量為2.625 g·L-1，優(yōu)化后多殺菌素含量提高了43.99%。

多殺菌素是一種極具前景的新型農(nóng)用抗生素，因此，研發(fā)成熟的多殺菌素工業(yè)化生產(chǎn)工藝具有極重要的意義。張瀚等[20]利用1株通過(guò)基因重排獲得的誘變菌株進(jìn)行試驗(yàn)，得到影響該菌株發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的最佳油脂為山茶油，且在0 h添加15.0 g·L-1效果最好。通過(guò)培養(yǎng)基成分響應(yīng)面試驗(yàn)獲得優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，并在5 L的發(fā)酵罐中通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵，使多殺菌素產(chǎn)量達(dá)到了512.36 mg·L-1，誘變株的多殺菌素產(chǎn)量顯著提高。由以上研究結(jié)果可以看出，雖然其發(fā)酵水平較低，但卻提供了一種較為全面的研究思路，即對(duì)現(xiàn)有菌株進(jìn)行基因改造，并圍繞發(fā)酵培養(yǎng)基中的重要組分進(jìn)行深入試驗(yàn)，將有可能使多殺菌素的發(fā)酵水平得到新的突破。

本研究為刺糖多孢菌發(fā)酵提供了可靠的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了多殺菌素增產(chǎn)目標(biāo)，為加快多殺菌素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有益的參考。