梁佳文,魏鐵鎖,樊曉培,蒼 晶,張 達
(東北農業(yè)大學生命科學學院,黑龍江哈爾濱 150030)
小麥是全世界種植面積最大的糧食作物之一,低溫作為主要的非生物脅迫因子,限制小麥的種植范圍和產量。植物對低溫的應答是一個涉及多基因、多信號途徑的復雜過程[1]。茉莉酸(Jasmonate,JA)是植物體內普遍存在的一類氧化脂類化合物,可調節(jié)植物發(fā)育和生物與非生物脅迫響應過程[2],誘導植物抗寒基因的表達,進而增強植物的抗寒性[3]。JA信號轉導的核心模塊是COI1/JAZ/MYC2復合體[4],轉錄抑制因子JAZ蛋白、MYC2轉錄因子和E3泛素連接酶SCFCOI1等相互作用,共同參與JA信號轉導過程[5]。
JAZ是一類阻遏蛋白,參與多個信號通路的調控,調節(jié)JA應答,在植物防御、生長發(fā)育、葉片衰老等方面發(fā)揮重要作用[6]。在JA濃度較低時,JAZ蛋白與轉錄激活因子MYC2結合,通過抑制MYC2的活性來抑制JA早期應答基因的表達,誘導植物內源JA的合成與積累;高濃度的JA促使JAZ蛋白與SCFCOI1受體復合物結合,導致JAZ蛋白被泛素化,進而被26S蛋白酶體降解,從而解除JAZ蛋白對MYC2的轉錄抑制,激活JA早期應答基因的表達[6]。
ICE-CBF-COR途徑是高等植物體內主要的抗寒途徑。ICE1是ICE-CBF-COR通路的關鍵調控因子,ICE1結合CBF3基因啟動子的MYC結合位點(CANNTG),并在冷處理下激活CBF3基因的表達[7]。在擬南芥中,AtJAZ1、AtJAZ4與AtICE1蛋白互作,抑制AtICE1基因的轉錄;且過表達AtJAZ1或AtJAZ4基因的擬南芥抗凍性均降低,說明AtJAZ1、AtJAZ4蛋白負調控擬南芥的抗凍性[4]。然而JAZ蛋白是否參與調控小麥的抗寒性尚未見報道。小麥中已經分離鑒定出14個JAZ基因,其中,TaJAZ7與AtJAZ1、TaJAZ12與AtJAZ4有較高的同源性[8]。小麥TaICE41是擬南芥AtICE1基因的同源基因[9]。趙 虎等[10]研究發(fā)現(xiàn),茉莉酸甲酯(MeJA)提高了東農冬麥1號(Dn1)的抗寒性,TaMYC2基因正調控Dn1的抗寒性;樊曉培等[11]研究發(fā)現(xiàn),MeJA處理提高了低溫脅迫下Dn1中冷響應基因TaWcor14、TaWcor15、TaWcor18、TaWcor413和TaICE41的表達量。為進一步探究JAZ蛋白在冬小麥抗寒中的作用,本研究檢測低溫脅迫下外源MeJA對TaJAZ7和TaJAZ12基因在Dn1中表達模式的影響,并對低溫脅迫下響應程度較為明顯的TaJAZ7(以TaJAZ7D為例)蛋白進行亞細胞定位,同時采用酵母雙雜技術對TaJAZ7D蛋白與TaMYC2、TaICE41蛋白之間的互作進行初步分析,以期為解析JA在調控冬小麥抗寒性的作用機制提供理論依據(jù)。
供試材料為強抗寒冬小麥品種東農冬麥1號(Dn1,可耐-30~-35 ℃),返青率大于85%,由東北農業(yè)大學農學院小麥室提供。于2018年9月8日將材料種植于東北農業(yè)大學校內試驗地,完全區(qū)組設計,共10行區(qū),小區(qū)行長約2 m,行距 0.2 m。每行播種150粒,播深5 cm,田間常規(guī)管理。于小麥三葉期(2018年9月24日),用1 mmol·L-1的MeJA噴施小麥葉片,以噴施等量蒸餾水為對照。待大田自然降溫、連續(xù)10 d平均最低溫度分別為5 ℃(2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月2日)、-10 ℃(2018年11月24日)和-25 ℃(2019年1月14日)時,取長勢一致的麥苗,蒸餾水洗凈,將分蘗節(jié)和葉片剪成0.5 cm小段,錫箔紙分別包裝,液氮速凍后,置于 -80 ℃冰箱保存,備用。
1.2.1 RNA的提取和實時熒光定量PCR分析
用Trizol法提取冬小麥分蘗節(jié)和葉片總RNA;用反轉錄試劑盒(全式金,北京)合成cDNA第一條鏈。用Primer Premier 6.0軟件設計TaJAZ7(TraesCS4D02G295900.1)和TaJAZ12(TraesCS6D02G274700.1)基因的qRT-PCR特異引物,以小麥TaActin為內參基因,引物序列見表1。按照TransStart TOP Green qPCR SuperMix試劑盒說明書(全式金,北京)的反應體系進行qRT-PCR反應,操作系統(tǒng)為Mx3000p Real-Time PCR Systerm(Stratagene,美國)。反應程序:94 ℃預變性30 s;94 ℃變性 5 s,60 ℃退火 30 s,40個循環(huán);94 ℃變性15 s, 60 ℃退火60 s, 94 ℃變性15 s。反應結束后,觀察曲線峰值是否單一以驗證試驗的準確性。采取2-△△Ct法計算基因的相對表達量,3次生物學重復,采用SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與顯著性分析。
1.2.2 TaJAZ7D蛋白的生物信息學分析
用在線軟件ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析TaJAZ7D蛋白的理化性質;用在線工具NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測TaJAZ7D蛋白的保守結構域[12];用在線程序ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預測TaJAZ7D蛋白的疏水區(qū)和親水區(qū);用MEGA 7.0的鄰接法(neighbor-Joining)對TaJAZ7A、TaJAZ7B和TaJAZ7D蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析;用在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)[13]和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[14]預測TaJAZ7D蛋白質的二級和三級結構。
1.2.3 TaJAZ7D蛋白的亞細胞定位
采用Primer Premier 6.0軟件設計pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP-F/R引物(表1),以TaJAZ7D基因的cDNA為模板進行PCR擴增。使用限制性內切酶BamHⅠ對pCAMBIA2300-EGFP載體進行酶切,PCR擴增產物和酶切產物回收純化后,用一步克隆試劑盒(諾唯贊,南京)進行同源重組并轉化將期至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中,挑取單菌落進行PCR檢測,然后送庫美生物科技有限公司進行測序驗證。將構建成功的重組載體pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP、空載體pCAMBIA2300-EGFP(對照)分別轉化至農桿菌感受態(tài)細胞GV3101中,挑取陽性單克隆, 28 ℃震蕩培養(yǎng)(220 r·min-1)12 h后離心收集菌體,用適量緩沖液(100μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸和10 mmol·L-1氯化鎂的懸浮液)重懸菌體,調整菌液濃度使其OD600=0.6~0.8,黑暗靜置4~6 h,然后將菌液注射至4周苗齡且長勢一致的本氏煙草葉片中,將注射過的煙草黑暗放置24 h后,弱光下培養(yǎng) 24 h,然后正常光照培養(yǎng)24 h。取干凈的載玻片,在載玻片上滴加幾滴4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液,用鑷子撕取注射過的煙草表皮葉片,放在DAPI染液中展平,蓋好蓋玻片,避光染色10 min。然后用蒸餾水沖去染液,濾紙吸除多余水分,利用正置熒光顯微鏡(OLYMPUS BX53)觀察細胞熒光定位情況。
表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study
1.2.4 酵母雙雜交試驗(驗證蛋白互作)
在Ensemble Plant在線網站獲得TaJAZ7D(Traes CS4D02G295900.1)、TaMYC2(Traes CS1D02G 196900)和TaICE41(Traes CS3A02G442200)基因的編碼區(qū)序列,用Primer premier 6.0設計引物(表1)。分別以提取的 -10 ℃和-25 ℃時的分蘗節(jié)cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用凝膠回收試劑盒(全式金,北京)進行目的條帶回收,并連接至pClone007 載體,將得到的重組載體pClone007-TaJAZ7D、pClone007-TaMYC2、pClone007-TaICE41轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中。經菌落PCR驗證后,挑取陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,搖菌送測序。使用DNAMAN 6.0軟件比對測序結果,若序列一致,表明這三個基因已成功被克隆,可用于后續(xù)試驗。
挑取酵母菌株AH109劃線于YPDA平板上,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右,挑取單克隆酵母制備酵母AH109感受態(tài)細胞。用EcoRⅠ分別酶切載體pGBKT7和pGADT7,按照Clon ExpressII One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊,南京)說明書將TaJAZ7D、TaMYC2、TaICE41基因分別與pGBKT7和pGADT7載體連接,然后轉化至酵母感受態(tài)細胞AH109中,點涂于二缺培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu上,倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2 d。待二缺培養(yǎng)基上長出適當大小的菌落后,將其擴大培養(yǎng),然后點涂在三缺培養(yǎng)基SD/-Trp-His-Leu和四缺培養(yǎng)基SD/-Trp-His-Leu-Ade上,30 ℃培養(yǎng)3~5 d。同時設pGBKT7-53+pGADT7為陽性對照,根據(jù)菌斑生長情況檢測轉錄自激活活性及其互作關系。
對小麥TaJAZ7、TaJAZ12蛋白與擬南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白進行進化分析,發(fā)現(xiàn) TaJAZ7蛋白與AtJAZ1蛋白聚為一個分支,同源性為100%; TaJAZ12蛋白與AtJAZ4蛋白也高度同源。因此,對低溫脅迫下冬小麥TaJAZ7、TaJAZ12基因的表達模式進行檢測,結果(表2)表明,Dn1分蘗節(jié)中,TaJAZ7基因的相對表達量隨著溫度的降低表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢,最大值出現(xiàn)在-25 ℃,最小值出現(xiàn)在-10 ℃;TaJAZ12基因的相對表達量表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢,最大值出現(xiàn)在0 ℃,最小值出現(xiàn)在 -25 ℃。外源MeJA處理降低了Dn1分蘗節(jié)中TaJAZ7和TaJAZ12基因的相對表達量(5 ℃時TaJAZ12基因的表達量除外),TaJAZ7基因的相對表達量隨著溫度的降低而降低,最大值出現(xiàn)在5 ℃,最小值出現(xiàn)在 -25 ℃;TaJAZ12基因的相對表達量隨著溫度的降低表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢,最大值出現(xiàn)在 5 ℃,最小值出現(xiàn)在0 ℃。
表2 外源MeJA對低溫脅迫下Dn1分蘗節(jié)及葉片中 TaJAZ7、 TaJAZ12基因相對表達量的影響Table 2 Effect of MeJA on the relative expression level of TaJAZ7 and TaJAZ12 genes in Dn1 tillers and leaves under low temperature
Dn1葉片中,TaJAZ7基因的相對表達量隨著溫度的降低表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢,TaJAZ12基因的相對表達量表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢,最大值均出現(xiàn)在-25 ℃,最小值均出現(xiàn)在-10 ℃。外源MeJA處理降低了TaJAZ7基因在-10 ℃和-25 ℃時的相對表達量以及TaJAZ12基因在0 ℃時的相對表達量。定量分析發(fā)現(xiàn),外源MeJA處理下Dn1葉片中TaJAZ7基因的表達量隨溫度降低呈明顯負相關。因此,本研究選取TaJAZ7蛋白做后續(xù)分子機制研究。
2.2.1 TaJAZ7蛋白的結構域
蛋白序列進化樹分析表明,TaJAZ7A蛋白與TaJAZ7D蛋白的同源性為100%, TaJAZ7A、TaJAZ7B和TaJAZ7D蛋白均具有JAZ家族典型的TIFY和CCT_2結構域,但所處的位置均不同,屬于TIFY轉錄因子超家族(圖1)。本研究以TaJAZ7D蛋白為研究對象進行后續(xù)分析。
圖1 TaJAZ7蛋白的結構域分析
2.2.2 TaJAZ7D蛋白的理化性質
序列分析結果表明,TaJAZ7D基因編碼區(qū)全長為633 bp,可編碼210個氨基酸。TaJAZ7D蛋白的相對分子量為21635.51Da,等電點(pI)為7.73,分子式為C946H1493N281O284S9,為弱堿性蛋白,屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白。
2.2.3 TaJAZ7D蛋白的二、三級結構
用SOPMA對TaJAZ7D蛋白進行二級結構預測,結果(圖2)顯示,TaJAZ7D蛋白的二級結構主要由α-螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲4種成分組成,分別占總蛋白的27.62%、14.29%、 6.67%和51.43%。預測結果表明,TaJAZ7D蛋白的二級結構為混合型。用SWISS-MODEL同源建模在線預測分析TaJAZ7D蛋白的三維模型,結果(圖2)表明,構建模板蛋白為7cvo.1[15], TaJAZ7D與模板蛋白的氨基酸序列同源性為66.67%,無配體,低聚糖狀態(tài)為異源二聚體,屬于TIFY家族。
圖2 TaJAZ7D蛋白的二級(左)、三級(右)結構預測
從圖3可見,在綠色熒光通道下,pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP融合蛋白在細胞核內有綠色熒光信號,表明TaJAZ7D蛋白位于細胞核內。
圖3 煙草表皮細胞中TaJAZ7D蛋白的亞細胞定位
用 TaJAZ7D-F/R、TaMYC2-F/R和TaICE- 41-F/R引物對目的基因TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41進行擴增,如圖4所示,PCR擴增條帶大小分別為633、2 088和1 152 bp。將目的基因分別連接至pClone007載體,并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,挑取陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中搖培并測序,若測序成功,表明目的基因已成功克隆。然后將目的基因分別連接至pGADT7和pGBKT7載體上,用 TaJAZ7D-F/R、TaMYC2-F/R和TaICE41-F/R引物對目的基因TaJA27D、TaMYC2和TaICE41進行驗證,如圖5所示,pGBKT7-TaICE41和pGADT7-TaICE41能擴增出1 152 bp的條帶,pGBKT7-TaJAZ7D和pGADT7-TaJAZ7D能擴增出633 bp的條帶,pGBKT7-TaMYC2和pGADT7-TaMYC2能擴增出2 088 bp的條帶,與目的基因條帶大小均一致,表明連接成功,可用于后續(xù)試驗。
從圖6可以看出,pGBKT7-53與pGADT7(陽性對照)共轉的酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-His-Leu和SD/-Trp-His-Leu-Ade營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上均生長良好。pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7、pGBKT7-TaMYC2與pGADT7、pGBKT7-TaICE41與pGADT7共轉的酵母菌在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上均生長良好,表明外源載體成功轉入酵母菌。在SD/-Trp-His-Leu培養(yǎng)基上,pGBKT7-TaJAZ7D能正常生長,而pGBKT7-TaICE41不能生長,pGBKT7-TaMYC2的生長也受到抑制。在SD/-Trp-His-Leu-Ade培養(yǎng)基上,pGBKT7-TaJAZ7D、pGBKT7-TaMYC2和pGBKT7-TaICE41均不能正常生長,表明TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41蛋白在酵母細胞中無自激活活性。
M:DL5000; 1 and 2:pGBKT7- TaICE41(1 152 bp); 3 and 4:pGADT7- TaICE41(1 152 bp); 5:pGBKT7- TaJAZ7D(633 bp); 6:pGADT7- TaJAZ7D(633 bp);7:pGBKT7-TaMYC2 (2 088 bp); 8:pGADT7- TaMYC2(2 088 bp).
100、10-1、10-2和10-3為4種不同稀釋液濃度的酵母菌液。圖7同。pGBKT7-53+pGADT7為陽性對照組,pGBKT7-TaJAZ7D+pGADT7、pGBKT7-TaMYC2+pGADT7和pGBKT7-TaICE41+pGADT7為試驗組。
從圖7可以看出,pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7-TaMYC2、pGBKT7-TaMYC2與pGADT7-TaJAZ7D、pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7-TaICE41、pGBKT7-TaICE41與pGADT7-TaJAZ7D共轉的酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-His-Leu和SD/-Trp-His-Leu-Ade培養(yǎng)基上均能正常生長,說明TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白均存在相互作用。
圖7 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白的互作驗證
研究表明,低溫提高了水稻[16]和擬南芥[4]內源JA的水平。JA參與植物CBF抗寒途徑,JA信號和CBF抗寒途徑元件間存在復雜的互作關系[17]。JAZ蛋白通過Jas結構域與ICE1和ICE2蛋白的C端結構域相互作用。如在擬南芥中,AtJAZ1和AtJAZ4蛋白通過抑制AtICE1基因的轉錄功能進而抑制下游AtCBF3基因的表達[4],MeJA處理顯著提高了ICE-CBF/DREB1信號因子下游AtCOR基因的表達量,增強了擬南芥的抗凍性;而阻斷內源JA的合成及信號轉導,則導致植物存活率降低、電導率升高以及對凍害敏感[4]。在香蕉中,MaMYC2s蛋白可通過與MaICE1蛋白互作,激活CBF途徑相關基因的表達,而JA作為ICE-CBF/DREB1途徑上游的關鍵信號因子,可正調控植物的抗寒性[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),JA提高了Dn1中冷響應基因和JA合成基因的表達量[10-11],增強了Dn1的抗寒性[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn),這主要與降低Dn1分蘗節(jié)和葉片中TaJAZ7基因的相對表達量相關,且在-10 ℃時作用最明顯。因為-10 ℃是Dn1抗寒的重要溫度節(jié)點,分蘗節(jié)是其順利越冬的主要部位[10],推測JAZ基因表達量的降低及JAZ蛋白的降解有利于解除對MYC2轉錄活性的阻遏,從而激活JA響應基因及下游靶基因的表達。
JAZ蛋白是JA信號從SCFCOI1受體復合物向下游JA應答基因轉導的紐帶[19]。本研究生物信學分析表明,Dn1中TaJAZ7D蛋白具有典型的TIFY和Jas結構域,這與前人的報道結果一致[17,20];亞細胞定位表明, TaJAZ7D蛋白位于細胞核中,這為與其他蛋白的互作提供了條件。TIFY結構域可介導JAZ蛋白與其共抑制因子NINJA(NOVEL INTERACTOR OF JAZ,JAZ接頭蛋白)相互作用或與其他JAZ接頭蛋白形成二聚體,共同抑制JA信號轉導[21];而Jas結構域則介導JAZ蛋白直接與JA信號通路上轉錄激活因子MYC2結合并抑制其轉錄活性,進而抑制JA應答基因的表達[22]。擬南芥中已分離鑒定出12個JAZ基因[20],小麥中已分離鑒定出14個JAZ基因[8],本研究進化分析表明,小麥TaJAZ7、TaJAZ12基因分別與擬南芥AtJAZ1、AtJAZ4基因高度同源?;跀M南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白分別與AtICE1、AtICE2蛋白互作可調控擬南芥的抗寒性[4],我們推測TaJAZ蛋白可能有類似的功能,而TaJAZ7蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白的互作驗證是首先需要解決的問題。
蛋白與蛋白互作在許多生物進程中起著至關重要的作用,酵母雙雜交試驗廣泛應用于互作蛋白的研究中。前人研究發(fā)現(xiàn),JAZ蛋白與轉錄因子MYB21和MYB24互作,可特異調控雄蕊發(fā)育[23];JAZ1蛋白可與bHLH類轉錄因子TT8、GL3和EGL3以及MYB類轉錄因子MYB75和GL1互作,抑制其轉錄活性,進而抑制毛狀體的發(fā)生和花青素的積累[24];JAZ1和JAZ4蛋白分別與ICE1和ICE2蛋白互作,可調節(jié)擬南芥的耐凍性[4];JAZ4和JAZ8蛋白與WRKY57蛋白互作,可調節(jié)JA誘導的葉片衰老[25];JAZ1蛋白與TOE1和TOE2蛋白互作,可調節(jié)開花時間[26];JAZ1、JAZ3和JAZ9蛋白與EIN3/EIL1蛋白互作,可介導JA和乙烯之間的激素串擾[27];赤霉素也可通過JAZ蛋白與DELLAs蛋白的互作來調節(jié)JA信號途徑[28]。小麥TaJAZ1蛋白(AtJAZ3的同源類似物)與TaABI5蛋白互作,通過ABA信號轉導途徑正調控小麥種子萌發(fā)和ABA響應基因的表達[29]。本研究發(fā)現(xiàn),Dn1 中 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2、TaICE41蛋白存在互作關系,推測這3個蛋白相互作用可調節(jié)Dn1的抗寒性。后續(xù)還需要結合雙分子熒光互補(BiFC)、GST pull down等技術對蛋白互作進行進一步驗證。