TaJAZ7D蛋白在冬小麥JA抗寒途徑中的作用

梁佳文，魏鐵鎖，樊曉培，蒼 晶，張 達

(東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

小麥是全世界種植面積最大的糧食作物之一，低溫作為主要的非生物脅迫因子，限制小麥的種植范圍和產量。植物對低溫的應答是一個涉及多基因、多信號途徑的復雜過程[1]。茉莉酸(Jasmonate,JA)是植物體內普遍存在的一類氧化脂類化合物，可調節(jié)植物發(fā)育和生物與非生物脅迫響應過程[2]，誘導植物抗寒基因的表達，進而增強植物的抗寒性[3]。JA信號轉導的核心模塊是COI1/JAZ/MYC2復合體[4]，轉錄抑制因子JAZ蛋白、MYC2轉錄因子和E3泛素連接酶SCFCOI1等相互作用，共同參與JA信號轉導過程[5]。

JAZ是一類阻遏蛋白，參與多個信號通路的調控，調節(jié)JA應答，在植物防御、生長發(fā)育、葉片衰老等方面發(fā)揮重要作用[6]。在JA濃度較低時，JAZ蛋白與轉錄激活因子MYC2結合，通過抑制MYC2的活性來抑制JA早期應答基因的表達，誘導植物內源JA的合成與積累；高濃度的JA促使JAZ蛋白與SCFCOI1受體復合物結合，導致JAZ蛋白被泛素化，進而被26S蛋白酶體降解，從而解除JAZ蛋白對MYC2的轉錄抑制，激活JA早期應答基因的表達[6]。

ICE-CBF-COR途徑是高等植物體內主要的抗寒途徑。ICE1是ICE-CBF-COR通路的關鍵調控因子，ICE1結合CBF3基因啟動子的MYC結合位點(CANNTG)，并在冷處理下激活CBF3基因的表達[7]。在擬南芥中，AtJAZ1、AtJAZ4與AtICE1蛋白互作，抑制AtICE1基因的轉錄；且過表達AtJAZ1或AtJAZ4基因的擬南芥抗凍性均降低，說明AtJAZ1、AtJAZ4蛋白負調控擬南芥的抗凍性[4]。然而JAZ蛋白是否參與調控小麥的抗寒性尚未見報道。小麥中已經分離鑒定出14個JAZ基因，其中，TaJAZ7與AtJAZ1、TaJAZ12與AtJAZ4有較高的同源性[8]。小麥TaICE41是擬南芥AtICE1基因的同源基因[9]。趙 虎等[10]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯(MeJA)提高了東農冬麥1號(Dn1)的抗寒性，TaMYC2基因正調控Dn1的抗寒性；樊曉培等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MeJA處理提高了低溫脅迫下Dn1中冷響應基因TaWcor14、TaWcor15、TaWcor18、TaWcor413和TaICE41的表達量。為進一步探究JAZ蛋白在冬小麥抗寒中的作用，本研究檢測低溫脅迫下外源MeJA對TaJAZ7和TaJAZ12基因在Dn1中表達模式的影響，并對低溫脅迫下響應程度較為明顯的TaJAZ7(以TaJAZ7D為例)蛋白進行亞細胞定位，同時采用酵母雙雜技術對TaJAZ7D蛋白與TaMYC2、TaICE41蛋白之間的互作進行初步分析，以期為解析JA在調控冬小麥抗寒性的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為強抗寒冬小麥品種東農冬麥1號(Dn1，可耐-30～-35 ℃)，返青率大于85%，由東北農業(yè)大學農學院小麥室提供。于2018年9月8日將材料種植于東北農業(yè)大學校內試驗地，完全區(qū)組設計，共10行區(qū)，小區(qū)行長約2 m，行距 0.2 m。每行播種150粒，播深5 cm，田間常規(guī)管理。于小麥三葉期(2018年9月24日)，用1 mmol·L-1的MeJA噴施小麥葉片，以噴施等量蒸餾水為對照。待大田自然降溫、連續(xù)10 d平均最低溫度分別為5 ℃(2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月2日)、-10 ℃(2018年11月24日)和-25 ℃(2019年1月14日)時，取長勢一致的麥苗，蒸餾水洗凈，將分蘗節(jié)和葉片剪成0.5 cm小段，錫箔紙分別包裝，液氮速凍后，置于 -80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取和實時熒光定量PCR分析

用Trizol法提取冬小麥分蘗節(jié)和葉片總RNA；用反轉錄試劑盒(全式金，北京)合成cDNA第一條鏈。用Primer Premier 6.0軟件設計TaJAZ7(TraesCS4D02G295900.1)和TaJAZ12(TraesCS6D02G274700.1)基因的qRT-PCR特異引物，以小麥TaActin為內參基因，引物序列見表1。按照TransStart TOP Green qPCR SuperMix試劑盒說明書(全式金，北京)的反應體系進行qRT-PCR反應，操作系統(tǒng)為Mx3000p Real-Time PCR Systerm(Stratagene，美國)。反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，40個循環(huán)；94 ℃變性15 s， 60 ℃退火60 s， 94 ℃變性15 s。反應結束后，觀察曲線峰值是否單一以驗證試驗的準確性。采取2-△△Ct法計算基因的相對表達量，3次生物學重復，采用SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與顯著性分析。

1.2.2 TaJAZ7D蛋白的生物信息學分析

用在線軟件ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析TaJAZ7D蛋白的理化性質；用在線工具NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測TaJAZ7D蛋白的保守結構域[12]；用在線程序ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預測TaJAZ7D蛋白的疏水區(qū)和親水區(qū)；用MEGA 7.0的鄰接法(neighbor-Joining)對TaJAZ7A、TaJAZ7B和TaJAZ7D蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析；用在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)[13]和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[14]預測TaJAZ7D蛋白質的二級和三級結構。

1.2.3 TaJAZ7D蛋白的亞細胞定位

采用Primer Premier 6.0軟件設計pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP-F/R引物(表1)，以TaJAZ7D基因的cDNA為模板進行PCR擴增。使用限制性內切酶BamHⅠ對pCAMBIA2300-EGFP載體進行酶切，PCR擴增產物和酶切產物回收純化后，用一步克隆試劑盒(諾唯贊，南京)進行同源重組并轉化將期至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，挑取單菌落進行PCR檢測，然后送庫美生物科技有限公司進行測序驗證。將構建成功的重組載體pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP、空載體pCAMBIA2300-EGFP(對照)分別轉化至農桿菌感受態(tài)細胞GV3101中，挑取陽性單克隆， 28 ℃震蕩培養(yǎng)(220 r·min-1)12 h后離心收集菌體，用適量緩沖液(100μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸和10 mmol·L-1氯化鎂的懸浮液)重懸菌體，調整菌液濃度使其OD600=0.6～0.8，黑暗靜置4～6 h，然后將菌液注射至4周苗齡且長勢一致的本氏煙草葉片中，將注射過的煙草黑暗放置24 h后，弱光下培養(yǎng) 24 h，然后正常光照培養(yǎng)24 h。取干凈的載玻片，在載玻片上滴加幾滴4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液，用鑷子撕取注射過的煙草表皮葉片，放在DAPI染液中展平，蓋好蓋玻片，避光染色10 min。然后用蒸餾水沖去染液，濾紙吸除多余水分，利用正置熒光顯微鏡(OLYMPUS BX53)觀察細胞熒光定位情況。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 酵母雙雜交試驗(驗證蛋白互作)

在Ensemble Plant在線網站獲得TaJAZ7D(Traes CS4D02G295900.1)、TaMYC2(Traes CS1D02G 196900)和TaICE41(Traes CS3A02G442200)基因的編碼區(qū)序列，用Primer premier 6.0設計引物(表1)。分別以提取的 -10 ℃和-25 ℃時的分蘗節(jié)cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠回收試劑盒(全式金，北京)進行目的條帶回收，并連接至pClone007 載體，將得到的重組載體pClone007-TaJAZ7D、pClone007-TaMYC2、pClone007-TaICE41轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中。經菌落PCR驗證后，挑取陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌送測序。使用DNAMAN 6.0軟件比對測序結果，若序列一致，表明這三個基因已成功被克隆，可用于后續(xù)試驗。

挑取酵母菌株AH109劃線于YPDA平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右，挑取單克隆酵母制備酵母AH109感受態(tài)細胞。用EcoRⅠ分別酶切載體pGBKT7和pGADT7，按照Clon ExpressII One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊，南京)說明書將TaJAZ7D、TaMYC2、TaICE41基因分別與pGBKT7和pGADT7載體連接，然后轉化至酵母感受態(tài)細胞AH109中，點涂于二缺培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu上，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。待二缺培養(yǎng)基上長出適當大小的菌落后，將其擴大培養(yǎng)，然后點涂在三缺培養(yǎng)基SD/-Trp-His-Leu和四缺培養(yǎng)基SD/-Trp-His-Leu-Ade上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。同時設pGBKT7-53+pGADT7為陽性對照，根據(jù)菌斑生長情況檢測轉錄自激活活性及其互作關系。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA對低溫脅迫下冬小麥 TaJAZ7、 TaJAZ12基因表達模式的影響

對小麥TaJAZ7、TaJAZ12蛋白與擬南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白進行進化分析，發(fā)現(xiàn) TaJAZ7蛋白與AtJAZ1蛋白聚為一個分支，同源性為100%； TaJAZ12蛋白與AtJAZ4蛋白也高度同源。因此，對低溫脅迫下冬小麥TaJAZ7、TaJAZ12基因的表達模式進行檢測，結果(表2)表明，Dn1分蘗節(jié)中，TaJAZ7基因的相對表達量隨著溫度的降低表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢，最大值出現(xiàn)在-25 ℃，最小值出現(xiàn)在-10 ℃；TaJAZ12基因的相對表達量表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢，最大值出現(xiàn)在0 ℃，最小值出現(xiàn)在 -25 ℃。外源MeJA處理降低了Dn1分蘗節(jié)中TaJAZ7和TaJAZ12基因的相對表達量(5 ℃時TaJAZ12基因的表達量除外)，TaJAZ7基因的相對表達量隨著溫度的降低而降低，最大值出現(xiàn)在5 ℃，最小值出現(xiàn)在 -25 ℃；TaJAZ12基因的相對表達量隨著溫度的降低表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢，最大值出現(xiàn)在 5 ℃，最小值出現(xiàn)在0 ℃。

表2 外源MeJA對低溫脅迫下Dn1分蘗節(jié)及葉片中 TaJAZ7、 TaJAZ12基因相對表達量的影響Table 2 Effect of MeJA on the relative expression level of TaJAZ7 and TaJAZ12 genes in Dn1 tillers and leaves under low temperature

Dn1葉片中，TaJAZ7基因的相對表達量隨著溫度的降低表現(xiàn)為先降后升的變化趨勢，TaJAZ12基因的相對表達量表現(xiàn)為“升-降-升”的變化趨勢，最大值均出現(xiàn)在-25 ℃，最小值均出現(xiàn)在-10 ℃。外源MeJA處理降低了TaJAZ7基因在-10 ℃和-25 ℃時的相對表達量以及TaJAZ12基因在0 ℃時的相對表達量。定量分析發(fā)現(xiàn)，外源MeJA處理下Dn1葉片中TaJAZ7基因的表達量隨溫度降低呈明顯負相關。因此，本研究選取TaJAZ7蛋白做后續(xù)分子機制研究。

2.2 TaJAZ7D蛋白的生物信息學

2.2.1 TaJAZ7蛋白的結構域

蛋白序列進化樹分析表明，TaJAZ7A蛋白與TaJAZ7D蛋白的同源性為100%， TaJAZ7A、TaJAZ7B和TaJAZ7D蛋白均具有JAZ家族典型的TIFY和CCT_2結構域，但所處的位置均不同，屬于TIFY轉錄因子超家族(圖1)。本研究以TaJAZ7D蛋白為研究對象進行后續(xù)分析。

圖1 TaJAZ7蛋白的結構域分析

2.2.2 TaJAZ7D蛋白的理化性質

序列分析結果表明，TaJAZ7D基因編碼區(qū)全長為633 bp，可編碼210個氨基酸。TaJAZ7D蛋白的相對分子量為21635.51Da，等電點(pI)為7.73，分子式為C946H1493N281O284S9，為弱堿性蛋白，屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白。

2.2.3 TaJAZ7D蛋白的二、三級結構

用SOPMA對TaJAZ7D蛋白進行二級結構預測，結果(圖2)顯示，TaJAZ7D蛋白的二級結構主要由α-螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲4種成分組成,分別占總蛋白的27.62%、14.29%、 6.67%和51.43%。預測結果表明，TaJAZ7D蛋白的二級結構為混合型。用SWISS-MODEL同源建模在線預測分析TaJAZ7D蛋白的三維模型，結果(圖2)表明，構建模板蛋白為7cvo.1[15]， TaJAZ7D與模板蛋白的氨基酸序列同源性為66.67%，無配體，低聚糖狀態(tài)為異源二聚體，屬于TIFY家族。

圖2 TaJAZ7D蛋白的二級(左)、三級(右)結構預測

2.3 TaJAZ7D蛋白的亞細胞定位

從圖3可見，在綠色熒光通道下，pCAMBIA2300-TaJAZ7D-EGFP融合蛋白在細胞核內有綠色熒光信號，表明TaJAZ7D蛋白位于細胞核內。

圖3 煙草表皮細胞中TaJAZ7D蛋白的亞細胞定位

2.4 目的基因克隆及重組載體構建結果

用 TaJAZ7D-F/R、TaMYC2-F/R和TaICE- 41-F/R引物對目的基因TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41進行擴增，如圖4所示，PCR擴增條帶大小分別為633、2 088和1 152 bp。將目的基因分別連接至pClone007載體，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取陽性單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中搖培并測序，若測序成功，表明目的基因已成功克隆。然后將目的基因分別連接至pGADT7和pGBKT7載體上，用 TaJAZ7D-F/R、TaMYC2-F/R和TaICE41-F/R引物對目的基因TaJA27D、TaMYC2和TaICE41進行驗證，如圖5所示，pGBKT7-TaICE41和pGADT7-TaICE41能擴增出1 152 bp的條帶，pGBKT7-TaJAZ7D和pGADT7-TaJAZ7D能擴增出633 bp的條帶，pGBKT7-TaMYC2和pGADT7-TaMYC2能擴增出2 088 bp的條帶，與目的基因條帶大小均一致，表明連接成功，可用于后續(xù)試驗。

2.5 TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41蛋白的體外自激活驗證結果

從圖6可以看出，pGBKT7-53與pGADT7(陽性對照)共轉的酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-His-Leu和SD/-Trp-His-Leu-Ade營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上均生長良好。pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7、pGBKT7-TaMYC2與pGADT7、pGBKT7-TaICE41與pGADT7共轉的酵母菌在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上均生長良好，表明外源載體成功轉入酵母菌。在SD/-Trp-His-Leu培養(yǎng)基上，pGBKT7-TaJAZ7D能正常生長，而pGBKT7-TaICE41不能生長，pGBKT7-TaMYC2的生長也受到抑制。在SD/-Trp-His-Leu-Ade培養(yǎng)基上，pGBKT7-TaJAZ7D、pGBKT7-TaMYC2和pGBKT7-TaICE41均不能正常生長，表明TaJAZ7D、TaMYC2和TaICE41蛋白在酵母細胞中無自激活活性。

M:DL5000; 1 and 2:pGBKT7- TaICE41(1 152 bp); 3 and 4:pGADT7- TaICE41(1 152 bp); 5:pGBKT7- TaJAZ7D(633 bp); 6:pGADT7- TaJAZ7D(633 bp);7:pGBKT7-TaMYC2 (2 088 bp); 8:pGADT7- TaMYC2(2 088 bp).

100、10-1、10-2和10-3為4種不同稀釋液濃度的酵母菌液。圖7同。pGBKT7-53+pGADT7為陽性對照組，pGBKT7-TaJAZ7D+pGADT7、pGBKT7-TaMYC2+pGADT7和pGBKT7-TaICE41+pGADT7為試驗組。

2.6 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白互作的酵母雙雜交鑒定結果

從圖7可以看出，pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7-TaMYC2、pGBKT7-TaMYC2與pGADT7-TaJAZ7D、pGBKT7-TaJAZ7D與pGADT7-TaICE41、pGBKT7-TaICE41與pGADT7-TaJAZ7D共轉的酵母菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-His-Leu和SD/-Trp-His-Leu-Ade培養(yǎng)基上均能正常生長，說明TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白均存在相互作用。

圖7 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白的互作驗證

3 討 論

研究表明，低溫提高了水稻[16]和擬南芥[4]內源JA的水平。JA參與植物CBF抗寒途徑，JA信號和CBF抗寒途徑元件間存在復雜的互作關系[17]。JAZ蛋白通過Jas結構域與ICE1和ICE2蛋白的C端結構域相互作用。如在擬南芥中，AtJAZ1和AtJAZ4蛋白通過抑制AtICE1基因的轉錄功能進而抑制下游AtCBF3基因的表達[4]，MeJA處理顯著提高了ICE-CBF/DREB1信號因子下游AtCOR基因的表達量，增強了擬南芥的抗凍性；而阻斷內源JA的合成及信號轉導，則導致植物存活率降低、電導率升高以及對凍害敏感[4]。在香蕉中，MaMYC2s蛋白可通過與MaICE1蛋白互作，激活CBF途徑相關基因的表達，而JA作為ICE-CBF/DREB1途徑上游的關鍵信號因子，可正調控植物的抗寒性[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，JA提高了Dn1中冷響應基因和JA合成基因的表達量[10-11]，增強了Dn1的抗寒性[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這主要與降低Dn1分蘗節(jié)和葉片中TaJAZ7基因的相對表達量相關，且在-10 ℃時作用最明顯。因為-10 ℃是Dn1抗寒的重要溫度節(jié)點，分蘗節(jié)是其順利越冬的主要部位[10]，推測JAZ基因表達量的降低及JAZ蛋白的降解有利于解除對MYC2轉錄活性的阻遏，從而激活JA響應基因及下游靶基因的表達。

JAZ蛋白是JA信號從SCFCOI1受體復合物向下游JA應答基因轉導的紐帶[19]。本研究生物信學分析表明，Dn1中TaJAZ7D蛋白具有典型的TIFY和Jas結構域，這與前人的報道結果一致[17,20]；亞細胞定位表明， TaJAZ7D蛋白位于細胞核中，這為與其他蛋白的互作提供了條件。TIFY結構域可介導JAZ蛋白與其共抑制因子NINJA(NOVEL INTERACTOR OF JAZ，JAZ接頭蛋白)相互作用或與其他JAZ接頭蛋白形成二聚體，共同抑制JA信號轉導[21]；而Jas結構域則介導JAZ蛋白直接與JA信號通路上轉錄激活因子MYC2結合并抑制其轉錄活性，進而抑制JA應答基因的表達[22]。擬南芥中已分離鑒定出12個JAZ基因[20]，小麥中已分離鑒定出14個JAZ基因[8]，本研究進化分析表明，小麥TaJAZ7、TaJAZ12基因分別與擬南芥AtJAZ1、AtJAZ4基因高度同源?；跀M南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白分別與AtICE1、AtICE2蛋白互作可調控擬南芥的抗寒性[4]，我們推測TaJAZ蛋白可能有類似的功能，而TaJAZ7蛋白與TaMYC2和TaICE41蛋白的互作驗證是首先需要解決的問題。

蛋白與蛋白互作在許多生物進程中起著至關重要的作用，酵母雙雜交試驗廣泛應用于互作蛋白的研究中。前人研究發(fā)現(xiàn)，JAZ蛋白與轉錄因子MYB21和MYB24互作，可特異調控雄蕊發(fā)育[23]；JAZ1蛋白可與bHLH類轉錄因子TT8、GL3和EGL3以及MYB類轉錄因子MYB75和GL1互作，抑制其轉錄活性，進而抑制毛狀體的發(fā)生和花青素的積累[24]；JAZ1和JAZ4蛋白分別與ICE1和ICE2蛋白互作，可調節(jié)擬南芥的耐凍性[4]；JAZ4和JAZ8蛋白與WRKY57蛋白互作，可調節(jié)JA誘導的葉片衰老[25]；JAZ1蛋白與TOE1和TOE2蛋白互作，可調節(jié)開花時間[26]；JAZ1、JAZ3和JAZ9蛋白與EIN3/EIL1蛋白互作，可介導JA和乙烯之間的激素串擾[27]；赤霉素也可通過JAZ蛋白與DELLAs蛋白的互作來調節(jié)JA信號途徑[28]。小麥TaJAZ1蛋白(AtJAZ3的同源類似物)與TaABI5蛋白互作，通過ABA信號轉導途徑正調控小麥種子萌發(fā)和ABA響應基因的表達[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dn1 中 TaJAZ7D蛋白與TaMYC2、TaICE41蛋白存在互作關系，推測這3個蛋白相互作用可調節(jié)Dn1的抗寒性。后續(xù)還需要結合雙分子熒光互補(BiFC)、GST pull down等技術對蛋白互作進行進一步驗證。