響應(yīng)面法優(yōu)化蒼術(shù)揮發(fā)油提取工藝及其抑菌活性研究＊

趙 彪，張科藝，馬文敏，王 洋

（1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.商洛學(xué)院商洛市中藥材病蟲(chóng)害綜合防治技術(shù)研究中心，陜西 商洛 726000；3.商洛學(xué)院陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 商洛 726000；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

蒼術(shù)是菊科植物茅蒼術(shù)（Atractylodes lancea（Thunb.）DC.）或北蒼術(shù)（Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.）的干燥根莖，作為中國(guó)著名的野生中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]。蒼術(shù)主要含蒼術(shù)素、蒼術(shù)醇、β-桉葉醇、蒼術(shù)內(nèi)酯、茅術(shù)酮等揮發(fā)性成分[2-4]，司燥濕健脾、明目之功，主治濕阻中焦、脘腹脹滿(mǎn)、泄瀉、水腫、腳氣痿躄、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、夜盲和眼目昏澀[1，4]。蒼術(shù)揮發(fā)油內(nèi)含多種藥理活性成分[5]，本研究以蒼術(shù)為主材料，對(duì)其揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行研究。蒼術(shù)揮發(fā)油的提取在中藥制劑和生產(chǎn)中是一個(gè)難點(diǎn)。中國(guó)揮發(fā)油提取的傳統(tǒng)方法為水蒸氣蒸餾法，但其提取需高溫蒸餾，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油中含有的熱不穩(wěn)定成分損失較多，嚴(yán)重影響其藥用活性?，F(xiàn)今揮發(fā)油提取技術(shù)趨向于多技術(shù)聯(lián)用[6]，故本研究擬用減壓輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，通過(guò)調(diào)控真空度，降低溶劑水的沸點(diǎn)，使其處于低溫沸騰狀態(tài)，從而減少熱不穩(wěn)定成分的損失。

1 材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蒼術(shù)（產(chǎn)地：商洛，購(gòu)于致天然旗艦店）；紅四氮唑（TTC），飛凈生物科技有限公司；無(wú)水硫酸銅，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；MH肉湯，海博生物技術(shù)有限公司；可溶性淀粉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（ANYO），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAN-1001），高低溫震蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160C型），紫外分光光度計(jì)（美析UV1100），超凈工作臺(tái)；手提式中藥粉碎機(jī)，電子天平（舜宇FB323），標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩。

2 方法

2.1 蒼術(shù)揮發(fā)油單因素條件的篩選

將用于測(cè)定的供試品粉碎，后過(guò)2-3號(hào)篩。以水蒸氣蒸餾法聯(lián)用減壓技術(shù)建立最佳提取工藝，主要考察輔助壓力、液料比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響[7]，以各項(xiàng)中最優(yōu)條件作為后續(xù)的提取條件，每組3次重復(fù)。

輔助壓力的單因素實(shí)驗(yàn)：稱(chēng)取20 g蒼術(shù)粉置于圓底燒瓶中，加入10倍體積的水，輔助壓力分別設(shè)置為0.1 MPa、0.09 MPa、0.08 MPa、0.07 MPa、0.06 MPa、0.05 MPa，在90℃下蒸餾5.0 h，餾出液加入5 g無(wú)水硫酸鈉，抽濾后回收溶劑，稱(chēng)量質(zhì)量，并計(jì)算揮發(fā)油得率[8]。

參照輔助壓力實(shí)驗(yàn)，分別在1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的液料比下，50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的溫度梯度下，1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h的時(shí)間梯度下，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2．2．1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平確定

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)率影響較大的3個(gè)因素及每一因素的前3個(gè)水平作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三因素三水平。

2．2．2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

將確定的三因素三水平輸入Design-Expert 8.0.6 Triar軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)中，根據(jù)Box-Behnken原理得到實(shí)驗(yàn)方案，依照方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2．2．3 響應(yīng)面的優(yōu)化分析及驗(yàn)證

以蒼術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)率為響應(yīng)值，進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得回歸方程，方程中各項(xiàng)系數(shù)的正負(fù)反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響方向，絕對(duì)值大小反映影響程度[9-10]。響應(yīng)曲面坡度越大，則對(duì)響應(yīng)值的影響越大。開(kāi)口朝下，表明該因素發(fā)展水平具最優(yōu)值，可進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化。等高線(xiàn)圖是曲面上相同的因素值在底面上形成的曲線(xiàn)，等高線(xiàn)越趨近于正圓，則兩因素的交互作用越??；等高線(xiàn)越趨近于橢圓，則兩因素的交互作用越大。等高線(xiàn)的密集程度反映了該因素對(duì)產(chǎn)油率的影響程度，等高線(xiàn)越密集，對(duì)出油率的影響就越大[11]。

2.3 抑菌活性測(cè)定

配置256 mL/L藥液、肉湯培養(yǎng)基（含TTC），將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后分別接種，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，紫外分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)菌濃度，使菌懸液OD600=0.5。將菌懸液稀釋100倍。在96孔板上采用二倍稀釋法配置系列濃度溶液[12]，依次加入2種稀釋菌懸液，培養(yǎng)12 h，觀察孔板顏色，確定最小抑菌濃度MIC。

3 結(jié)果

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由各單因素對(duì)產(chǎn)率影響結(jié)果可知，蒸餾時(shí)間在2.5 h后對(duì)產(chǎn)率影響較小，故選擇3.0 h作為提取時(shí)間；選取輔助壓力0.06～0.08 MPa、料液比1∶6～1∶10、溫度60～80℃作為后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化數(shù)據(jù)。

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平確定

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定提取時(shí)間為3.0 h，選取對(duì)蒼術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)率影響較大的輔助壓力、料液比、溫度3個(gè)因素，確定三因素三水平，因素水平表如表1所示。

表1 蒼術(shù)揮發(fā)油提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

以蒼術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)率作為響應(yīng)值，Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 BOX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.4 模型建立與回歸分析

運(yùn)用Design-Expert軟件，以蒼術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)率為響應(yīng)值，進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，獲得回歸方程：蒼術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)率=2.61-1.375×10-3A-0.026B-0.26C+4.5×10-3AB+0.15AC-0.072BC-0.29A2-0.28B2-0.38C2，由該方程可知提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響大于輔助壓力、大于料液比，該二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，則方程圖像開(kāi)口向下，具有最高點(diǎn)，故能進(jìn)行優(yōu)化。

蒼術(shù)揮發(fā)油提取回歸模型的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

由表3知，該模型的F值為69.01、P小于0.000 1，表明模型是極顯著；C、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值P均小于0.000 1，說(shuō)明C、A2、B2、C2對(duì)模型具有極顯著的影響，交互項(xiàng)AC、BC的P值小于0.05，說(shuō)明對(duì)模型具有顯著的影響。矢擬項(xiàng)Prob大于F值，為0.458 3，大于0.05，說(shuō)明擬合的回歸曲線(xiàn)符合實(shí)際情況，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)蒼術(shù)揮發(fā)油的提取率。

表3 蒼術(shù)揮發(fā)油提取回歸模型的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

表3（續(xù)）

由方差分析表4知，R2=0.988 9＞0.9、校正R2=0.974 5，表明該模型與實(shí)際擬合較好，該回歸曲線(xiàn)可以反映97.45%的響應(yīng)值變化。變異系數(shù)2.71%，表明模型能較好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值。

表4 蒼術(shù)揮發(fā)油提取回歸模型方差分析

3.5 等高線(xiàn)與響應(yīng)面分析

由等高線(xiàn)圖知，料液比、輔助壓力和提取溫度之間存在交互作用，各因素交互對(duì)蒼術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)率的影響依次為提取溫度、輔助壓力、料液比。

由響應(yīng)曲面圖結(jié)合回歸方程得到最佳提取參數(shù)：料液比1∶7.82、輔助壓力0.07 MPa、提取溫度66.4℃、蒸餾3 h，理論提取率可達(dá)2.653%。結(jié)合實(shí)驗(yàn)的可行性，將理想提取參數(shù)調(diào)整為料液比1∶7.8、輔助壓力0.07 MPa、提取溫度66.5℃、提取時(shí)間3 h。

3.6 最佳提取工藝的驗(yàn)證

在上述條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到蒼術(shù)揮發(fā)油平均產(chǎn)率為2.584%，RDS為1.534%，相對(duì)誤差1.376%，表明該模型具備較好的穩(wěn)定性。

3.7 抑菌活性測(cè)定

由96孔板顏色知，蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性顯著，其MIC值僅為4 mL/L；對(duì)大腸桿菌具有一定的抑菌活性，其MIC值為128 mL/L。

4 總結(jié)

本研究采用減壓輔助水蒸氣蒸餾法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化蒼術(shù)揮發(fā)油的提取工藝，得到在料液比1∶7.8、輔助壓力0.07 MPa、提取溫度66.5℃下蒸餾3 h，可使蒼術(shù)揮發(fā)油平均產(chǎn)率達(dá)2.584%，工藝穩(wěn)定性較好。

該工藝在水蒸氣蒸餾法的基礎(chǔ)上減壓輔助，可有效減少熱不穩(wěn)定活性成分的損壞，使有效成分較好的保留，縮短蒸餾時(shí)間，且產(chǎn)物活性較優(yōu)于常壓提取，可為蒼術(shù)揮發(fā)油生產(chǎn)提供理論依據(jù)。