新生兒遺傳性耳聾基因篩查及耳聾基因突變率的調(diào)查研究

郭 佳 張愛(ài)榮 劉婉玉

（駐馬店市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河南 駐馬店 463000）

聽(tīng)力障礙為殘障性的疾病，也是胎兒出生缺陷里較多見(jiàn)的疾病，人群在我國(guó)所患聽(tīng)力障礙者占總殘障患者的14%，每年我國(guó)的新生兒里，產(chǎn)生聽(tīng)力障礙的患兒為0.1%～0.3%，其中60%聽(tīng)力障礙的產(chǎn)生和遺傳性相關(guān)[1]。聽(tīng)力障礙會(huì)影響新生兒語(yǔ)言相關(guān)系統(tǒng)發(fā)育，進(jìn)而影響患兒成長(zhǎng)，加重患兒家庭以及社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。新生兒遺傳性耳聾基因篩查至關(guān)重要，能有效減少因遺傳因素導(dǎo)致患兒遲發(fā)性的耳聾漏診率。本研究調(diào)查探討新生兒遺傳性耳聾基因篩查及耳聾基因突變率，旨在為新生兒的聽(tīng)力障礙相關(guān)診療提供參考，現(xiàn)報(bào)告見(jiàn)下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取本院2019年2月至2020年2月婦產(chǎn)科進(jìn)行正常分娩新生兒148 例，新生兒的胎齡33～41 周，出生體重2322.13～4686.42g，其中男83 例，女65 例；平均胎齡（38.52±2.43）周，出生體重（3155.24±123.74）g。本研究由醫(yī)院倫理委審批合格，實(shí)驗(yàn)對(duì)象家長(zhǎng)知情同意。

1.2 方法：新生兒在出生后的48～72h 里進(jìn)行聽(tīng)力檢測(cè)，新生兒睡眠期間實(shí)施檢查，維持房間噪音低于40dB，對(duì)新生兒瞬態(tài)相關(guān)檢查運(yùn)用聲耳聲發(fā)射法檢測(cè)，檢查未通過(guò)的新生兒，在出生后的42d 里選取ERO·SCAN 德國(guó)麥科篩查儀進(jìn)行聽(tīng)性腦干相關(guān)反應(yīng)的復(fù)查，使用0.5mL/kg 的10%水合氯醛進(jìn)行新生兒的灌腸，在其睡眠狀態(tài)進(jìn)行單耳短聲的相關(guān)刺激，單側(cè)耳實(shí)施白噪音的屏蔽，0.1ms 刺激時(shí)間且疊加進(jìn)行2000 次，15ms 分析。若顯示新生兒未通過(guò)復(fù)查則于出生后第三個(gè)月進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)的相關(guān)診查，確診患兒聽(tīng)力實(shí)際情況。①DNA 的提?。核行律鷥涸谄涑錾蟮?2h 里取新生兒的足跟血采取常規(guī)遺傳性的耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)，紫外分光的光度計(jì)進(jìn)行末梢血的血斑DNA 純度以及濃度的提取，負(fù)70℃冰箱保存；②PCR 的擴(kuò)增：PCR 配液的實(shí)驗(yàn)區(qū)里依據(jù)被檢的樣品數(shù)目準(zhǔn)備雙倍離心管（兩套的離心管對(duì)同一樣品進(jìn)行不同位點(diǎn)的檢測(cè)），標(biāo)記管上的樣品，兩套管標(biāo)記需對(duì)應(yīng)。試劑盒提?。ˋB 管）PCR 擴(kuò)增引物的混合和PCR 擴(kuò)增混合物進(jìn)行自然的解凍，待充分進(jìn)行融化后實(shí)施旋渦式的震蕩進(jìn)行徹底的混勻，進(jìn)行離心到管底，依據(jù)20μL每份進(jìn)行分裝。每回實(shí)施PCR 的擴(kuò)增，需PCR 相關(guān)反應(yīng)體系增加兩個(gè)，其一個(gè)為對(duì)照品管添加5μL，質(zhì)控PCR 雜交以及擴(kuò)增的相關(guān)過(guò)程，空白對(duì)照選取純化水，實(shí)驗(yàn)操作以及環(huán)境的過(guò)程里其相關(guān)污染的情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。PCR 的擴(kuò)增是實(shí)驗(yàn)區(qū)里，把5μLDNA、12.5μLPCR 擴(kuò)增引物的混合物以及PCR擴(kuò)增試劑的混合物12.5μL 混合。依據(jù)試劑的擴(kuò)增條件實(shí)施熱循環(huán)，總反應(yīng)的時(shí)間約3h；③芯片的雜交：由A、B 的兩個(gè)PCR 體系里依次吸取磁珠的混合液以及結(jié)合的緩沖液相關(guān)PCR 的10μL 產(chǎn)物并添加到混合液里。充分混勻進(jìn)行堿變性，采取磁力架的吸附添加雜交的緩沖液并進(jìn)行充分的吹打，在芯片的微陣列區(qū)域里添加混合液，用蓋玻片進(jìn)行封閉，置于50℃的水箱里實(shí)施60min 的水??；④洗片并進(jìn)行干燥：將芯片取出后放入洗干儀里，在42 度的Ⅰ號(hào)洗滌液里進(jìn)行2min 的洗滌，接著取出其放入42 度的Ⅱ號(hào)洗滌液里再次進(jìn)行2min 的洗滌，選取離心機(jī)（1000r/min）進(jìn)行2min 的離心；⑤遺傳性的耳聾基因檢查試劑盒檢查4 個(gè)耳聾的易感基因，涉及9 個(gè)位點(diǎn)：線粒體12srRNA（1494C＞T 與1555A ＞G）、GJB2 （299delAT、176del16、35delG 與235delC）、GJB3（538C＞T）以及SLC26A4（IVS7-2A＞G 與2168A＞G）。耳聾基因相關(guān)檢測(cè)的分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀檢測(cè)的結(jié)果，實(shí)施微陣列芯片法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

新生兒耳聾基因里，單基因單雜合的突變?yōu)?例，其攜帶率6.08%，包含GJB2 基因的雜合突變6例（4.05%）；SLC26A4 基因的雜合突變3 例（2.03%），詳見(jiàn)表1。

表1 新生兒耳聾基因篩查各基因單雜合突變攜帶率

3 討論

伴隨優(yōu)生優(yōu)育思想受到重視，遺傳性的耳聾病癥受到重視，提倡產(chǎn)婦孕前進(jìn)行普查以及新生兒的篩查進(jìn)行遺傳性疾病的防控，我國(guó)遺傳性的耳聾是線粒體12srRNA、GJB2、GJB3 以及SLC26A4 相關(guān)基因的突變導(dǎo)致，這4 個(gè)基因皆具有高發(fā)熱點(diǎn)[3]。GJB2 基因?qū)儆陔[性遺傳，在遺傳性的耳聾基因里較多見(jiàn)。有研究表明[4]，GJB2 的基因其突變的主要類型為299delAT、176del16、35delG 以及235delC，本研究顯示，GJB2 單雜合的突變存在攜帶率明顯較多，235delC 的攜帶率為2.70%；299delAT 的攜帶率為1.35%。說(shuō)明GJB2 的基因里其235delC 的位點(diǎn)出現(xiàn)雜合相關(guān)突變更多見(jiàn)。該結(jié)果存在一定的差異性[5]，分析是因遺傳性的耳聾基因具備遺傳的異質(zhì)性較多，不同人群與地區(qū)的基因突變頻率及位點(diǎn)存在一定的差異性。新生兒實(shí)施相關(guān)耳聾基因檢測(cè)表明單基因的單雜合突變有可能是其攜帶者，實(shí)施基因相關(guān)測(cè)序能對(duì)其它位點(diǎn)是否出現(xiàn)突變進(jìn)行一一排除，攜帶者不會(huì)患病，但能將該基因進(jìn)行后代遺傳。若夫妻兩人皆攜帶GJB2 基因的單雜合突變，生育后代為聽(tīng)障患兒概率是25%[6]，臨床指導(dǎo)該產(chǎn)婦在產(chǎn)前實(shí)施耳聾基因相關(guān)檢測(cè)并進(jìn)行耳聾預(yù)警，耳聾基因檢測(cè)結(jié)合聽(tīng)力篩查至關(guān)重要。

SLC26A4 的基因雜合突變低于GJB2 突變導(dǎo)致感音神經(jīng)性的耳聾重要病因之一[7]。本研究顯示，SLC26A4 的基因相關(guān)雜合突變3 例（2.03%），其基因突變的攜帶率較高，IVS7-2A＞G 的突變2 例（1.35%）；2168A＞G 的突變1 例（0.68%）；提示SLC26A4 的基因里更多見(jiàn)的是IVS7-2A＞G 的突變。有研究表明[8]，SLC26A4 的基因里IVS7-2A＞G以及2168A＞G 相關(guān)突變和大前庭的導(dǎo)水管綜合征存在較高關(guān)聯(lián)性，其綜合征表現(xiàn)呈前庭的導(dǎo)水管且合并感音相關(guān)神經(jīng)性的耳聾。該病癥呈現(xiàn)常規(guī)染色體的隱性遺傳，其病發(fā)是經(jīng)兩個(gè)等位相關(guān)基因發(fā)生突變形成，攜帶者具有單個(gè)的等位基因突變，該基因能遺傳其后代，若夫妻皆是攜帶者，則后代患有該病危險(xiǎn)率高達(dá)25%。已確診患兒須實(shí)施聽(tīng)力等保健的指導(dǎo)，盡量避免患兒出現(xiàn)頭部碰撞、發(fā)熱以及感冒等導(dǎo)致耳內(nèi)壓提升的活動(dòng)，隨診發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力的變化實(shí)施早期的干預(yù)。大量研究表明[9]，線粒體12sr-RNA 基因里1494C＞T 以及1555A＞G 是由母系進(jìn)行遺傳，和藥物性的耳聾相關(guān)；其突變能改變?nèi)梭w線粒體12srRNA 空間的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生全新氨基糖甙類相關(guān)抗生素的結(jié)合位點(diǎn)，形成此類的藥物敏感性。本研究148 例樣本未檢測(cè)出線粒體12srRNA 的基因突變。但檢測(cè)線粒體12srRNA 的預(yù)警價(jià)值依舊不容忽視。有研究顯示[8-9]，GJB3 的基因產(chǎn)生突變由兩個(gè)常規(guī)染色體導(dǎo)致的耳聾進(jìn)行顯性相關(guān)遺傳，能導(dǎo)致常規(guī)染色體出現(xiàn)隱或顯性相關(guān)遺傳性的耳聾，538C＞T 突變被認(rèn)為和高頻的聽(tīng)力減弱相關(guān)。本研究對(duì)GJB3 的基因雜合突變未檢查出。說(shuō)明GJB3的基因相關(guān)突變出現(xiàn)在耳聾患者里的攜帶率明顯較低。

綜上所述，在新生兒里實(shí)施遺傳性耳聾基因篩查及耳聾基因突變率的調(diào)查研究具有重大意義，能早期診斷以及預(yù)防耳聾發(fā)生，且對(duì)攜帶耳聾相關(guān)基因者進(jìn)行婚配以及生育具有相關(guān)指導(dǎo)性。健康人群進(jìn)行耳聾基因的篩查，能降低遺傳性的耳聾患兒出生率，減少其出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。