紫象草原花青素提取物的制備條件優(yōu)化和體外抗氧化活性研究

劉賽格 冉思蛟 倪海花 杜 勇 高彥華 陳仕勇

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

原花青素(proanthocyanidins，PACs)是由黃烷-3-醇經(jīng)由類黃酮生物合成途徑形成的以低聚或多聚形式存在的多酚類化合物[1-2]，具有捕獲活性氧及其衍生自由基的生物活性[3]，是一類重要的天然抗氧化劑。原花青素純品的抗氧化活性優(yōu)于維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素及單體黃烷醇[4]，且其活性強(qiáng)弱與單體的聚合程度密切相關(guān)，低聚體如原花青素B2(proanthocyanidin B2，PAB2)抗氧化活性最強(qiáng)[5]。動(dòng)物飼糧中添加原花青素能夠減少脂肪沉積、緩解脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性[6-7]，起到改善肉品質(zhì)和保障腸道健康的作用。Liu等[8]研究表明，葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin，GSP)能通過調(diào)控腸道菌群的組成，緩解飼喂高脂飼糧小鼠體脂的過度沉積；Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加GSP能夠改變腸道菌群組成，降低體脂形成和減少脂質(zhì)過氧化，保持豬肉本來的風(fēng)味。

原花青素廣泛存在于多種植物的果實(shí)、種子、花、莖葉或樹皮當(dāng)中[10]，天然飼草是原花青素的重要來源之一。紫象草(PennisetumpurpureumSchumab)系禾本科多年生大型草本植物[11]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較同屬牧草高，且富含花色苷[12]。飼糧中添加20%發(fā)酵紫象草有利于改善桂科黑豬生長(zhǎng)性能、屠宰性能及肉品質(zhì)[13]。紫象草葉片的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析揭示，與綠色葉片相比，紫色葉片中花色苷和原花青素的合成通路顯著上調(diào)[14]。目前尚未見關(guān)于紫象草莖葉等各部位原花青素的提取、含量測(cè)定及其體外抗氧化活性的研究。因此，本研究擬采用PAB2為標(biāo)準(zhǔn)品，建立對(duì)-(二甲基氨基)肉桂醛[p-(dimethylamino) cinnamaldehyde，DMAC]法快速測(cè)定紫象草原花青素提取物含量，探究提取溶劑類型、提取溶劑濃度、料液比、溫度、時(shí)間5個(gè)單因素對(duì)其含量的影響，并通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳提取條件，最后測(cè)定紫象草原花青素提取物的體外抗氧化活性，為充分利用紫象草飼草資源、將紫象草原花青素開發(fā)為天然抗氧化劑提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料紫象草采自四川新津國(guó)家牧草試驗(yàn)站，同時(shí)采集了同屬植物皇竹草(PennisetumsineseRoxb)作為對(duì)照樣品(圖1)。

a：紫象草 Pennisetum purpureum Schumab；b：皇竹草 Pennisetum sinese Roxb。

主要試劑：PAB2標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購于上海源葉生物科技有限公司，總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測(cè)試劑盒、羥自由基(hydroxy radical，OH·)清除能力檢測(cè)試劑盒、總酚(total phenol，TP)含量檢測(cè)試劑盒、低聚原花青素(oligomeric proantho cyanidins，OPC)含量檢測(cè)試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基[2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical，ABTS·]清除能力檢測(cè)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，DMAC(純度≥98%)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，鹽酸、丙酮、無水乙醇、冰醋酸(均為分析純)購于成都市科龍化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ATY224型電子精密天平[島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司]、Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機(jī)(熱電實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，奧斯特羅德分公司)、KQ5200B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)、DS-11/DS-11+型超微量紫外/可見分光光度計(jì)(北京倍輝科技有限公司)、RG-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、LYOQUEST-85型冷凍干燥機(jī)(泰事達(dá)科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫象草原花青素提取物的制備

將紫象草按全株、莖、葉不同組分分割，于105 ℃烘干至恒重，粉碎、過40目篩，按料液比1∶110(g/mL)加入95%酸性丙酮(冰醋酸∶丙酮∶蒸餾水=1∶190∶9，體積比)，超聲提取60 min(25 ℃，400 W)，55 ℃水浴加熱60 min，分別通過中速定量濾紙、0.22 μm有機(jī)相尼龍濾膜，濾過液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮，冷凍干燥即得紫象草原花青素提取物，置于-80 ℃冰箱備用?；手癫萑~原花青素提取物的制備同上述流程。

1.3.2 紫象草原花青素提取條件單因素試驗(yàn)

以DMAC法測(cè)定PAB2含量，研究提取溶劑類型(蒸餾水、酸性甲醇、酸性乙醇、酸性丙酮、乙酸水溶液)、提取溶劑濃度(55%、65%、75%、85%、95%)、料液比(1∶5、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 g/mL)、提取溫度(20、30、40、50 ℃)、提取時(shí)間(10、30、50、70、90 min)5個(gè)單因素對(duì)PAB2含量的影響。每個(gè)反應(yīng)條件下設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 紫象草原花青素提取條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選得到提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素為自變量，以PAB2含量為因變量，利用Design Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)(表1)。

1.3.4 紫象草原花青素提取物含量的測(cè)定

1.3.4.1 PAB2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其含量測(cè)定

參照黃雪松等[15]的方法，以PAB2為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定紫象草原花青素提取物PAB2含量，具體操作如下：配制10 mg/mL的PAB2標(biāo)準(zhǔn)溶液并將其梯度稀釋；將標(biāo)準(zhǔn)溶液置于超微量紫外/可見分光光度計(jì)于400～700 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描；現(xiàn)配現(xiàn)用0.1%(g/mL)的DMAC酸性乙醇溶液(鹽酸∶蒸餾水∶乙醇=25∶25∶150，體積比)；按照稀釋液∶DMAC酸性乙醇溶液=1∶3(體積比)加入96孔板，室溫避光靜置反應(yīng)30 min，于643 nm處測(cè)定吸光度(OD)值；繪制PAB2標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程，代入下列公式計(jì)算得到紫象草全株、莖、葉及皇竹草葉提取物PAB2含量：

PAB2含量(mg/g)=(X×V×D)/M；式中：X為提取物PAB2濃度(mg/mL)；V為提取物溶液體積(mL)；D為提取物溶液稀釋倍數(shù)；M為提取物質(zhì)量(g)。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素和水平

1.3.4.2 OPC和TP含量的測(cè)定

以O(shè)PC為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定液與反應(yīng)液按1∶4(體積比)混勻，30 ℃水浴避光反應(yīng)30 min，于500 nm處測(cè)定OD值，代入下列公式計(jì)算得到提取物OPC含量：

OPC含量(mg/g)=(X×V×D)/M。

式中：X為提取物OPC濃度(mg/mL)；V為提取物溶液體積(mL)；D為提取物溶液稀釋倍數(shù)；M為提取物質(zhì)量(g)。

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定液與反應(yīng)液按1∶10(體積比)混勻，室溫避光靜置反應(yīng)10 min，于760 nm處測(cè)定OD值，代入下列公式計(jì)算得到提取物TP含量：

TP含量(mg/g)=(X×V×D)/M。

式中：X為提取物TP濃度(mg/mL)；V為提取物溶液體積(mL)；D為提取物溶液稀釋倍數(shù)；M為提取物質(zhì)量(g)。

1.3.5 紫象草原花青素提取物體外抗氧化活性的測(cè)定

以10 mmol/L維生素C為對(duì)照，測(cè)定液與反應(yīng)液按1∶19(體積比)混勻，室溫避光靜置反應(yīng)6 min，于405 nm處測(cè)定OD值，代入下列公式計(jì)算得到提取物對(duì)ABTS·的清除率：

ABTS·清除率(%)=[(A空白-A測(cè)定)/A空白]×100。

式中：A空白為未加提取物時(shí)ABTS·溶液的OD值；A測(cè)定為提取物與ABTS·反應(yīng)后溶液的OD值。

以10 mmol/L維生素C為對(duì)照，測(cè)定液與反應(yīng)液按1∶19(體積比)混勻，室溫避光靜置反應(yīng)20 min，于515 nm處測(cè)定OD值，代入下列公式計(jì)算得到提取物對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH·)的清除率：

DPPH·清除率(%)=[(A空白-A測(cè)定)/A空白]×100。

式中：A空白為未加提取物時(shí)DPPH·溶液的OD值；A測(cè)定為提取物與DPPH·反應(yīng)后溶液的OD值。

以100 mmol/L維生素C為對(duì)照，測(cè)定液與反應(yīng)液按1∶6(體積比)混勻，37 ℃孵育60 min，離心后取上清于536 nm處測(cè)定OD值，代入下列公式計(jì)算得到提取物對(duì)OH·的清除率：

OH·清除率(%)={[A空白-(A測(cè)定-A對(duì)照)]/
A空白}×100。

式中：A空白為未加提取物時(shí)反應(yīng)體系的OD值；A測(cè)定為提取物與體系反應(yīng)后溶液的OD值；A對(duì)照為提取物與同體積的蒸餾水反應(yīng)后溶液的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS 2019進(jìn)行整理，采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAB2標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

PAB2全波長(zhǎng)掃描及標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖2-a、圖2-b，其最大吸收峰值為643 nm，在0～1.0 mg/mL內(nèi)，PAB2標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值線性關(guān)系良好，回歸方程為：

y=3.093x+0.014 4 (R2=0.997 8)。

式中：x為PAB2標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)；y為OD值。

圖2 PAB2全波長(zhǎng)掃描及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 紫象草原花青素提取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溶劑類型對(duì)PAB2含量的影響

由圖3-a可知，以酸性丙酮作為提取劑時(shí)PAB2含量最高，達(dá)1.964 mg/g；以酸性乙醇作為提取劑時(shí)PAB2含量略低，達(dá)1.960 mg/g；以酸性丙酮、酸性乙醇作為提取劑時(shí)PAB2含量顯著高于以蒸餾水、酸性甲醇、乙酸水溶液作為提取劑時(shí)(P<0.05)，但兩者間差異不顯著(P>0.05)?？紤]到以酸性丙酮作為提取溶劑PAB2含量最高，故以酸性丙酮作為提取溶劑。

2.2.2 提取溶劑濃度對(duì)PAB2含量的影響

由圖3-b可知，以95%酸性丙酮進(jìn)行提取時(shí)PAB2含量最高，達(dá)2.66 mg/g，顯著高于其他濃度(P<0.05)，故以95%作為提取溶劑濃度。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)PAB2含量的影響

由圖3-c可知，在50～70 min，PAB2含量隨提取時(shí)間的增加而增加；90 min時(shí)，PAB2含量下降，故以50～70 min作為提取時(shí)間。

2.2.4 料液比對(duì)PAB2含量的影響

由圖3-d可知，料液比為1∶100 g/mL時(shí)PAB2含量最高，達(dá)5.57 mg/g；料液比為1∶80 g/mL時(shí)PAB2含量略低，達(dá)5.52 mg/g，料液比為1∶80、1∶100 g/mL時(shí)PAB2含量顯著高于料液比為1∶5、1∶20、1∶40、1∶60 g/mL時(shí)(P<0.05)，但料液比為1∶80、1∶100 g/mL之間差異不顯著(P>0.05)，考慮到料液比為1∶100 g/mL時(shí)PAB2含量最高，故以1∶100 g/mL作為提取料液比。

2.2.5 提取溫度對(duì)PAB2含量的影響

由圖3-e可知，PAB2含量隨提取溫度的增加而增加，50 ℃時(shí)最高，達(dá)4.22 mg/g，顯著高于其他提取溫度(P<0.05)，故以50 ℃作為提取溫度。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果及響應(yīng)面優(yōu)化模型方差分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取紫象草葉原花青素的試驗(yàn)結(jié)果見表2。以提取時(shí)間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)為自變量，以提取物PAB2含量(Y)為因變量，得到二次多項(xiàng)回歸方程如下：

Y=4.57-0.15A+0.44B+0.19C+0.25AB-
0.18AC+0.19BC-0.053A2-0.40B2-0.070C2。

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3，回歸模型P<0.05，失擬項(xiàng)P>0.05，相關(guān)系數(shù)(R2)=0.853，即該模型顯著且穩(wěn)定，可以較好地呈現(xiàn)因變量與自變量、實(shí)際值與理論值之間的相關(guān)性。綜上所述，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可靠，回歸方程擬合程度較好，適用于紫象草原花青素提取條件的優(yōu)化。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5、圖6同。Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.5 and Fig.6.

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)分組及結(jié)果

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3.2 提取條件互作對(duì)PAB2含量的影響

各因素交互作用對(duì)提取物PAB2含量的影響見圖4，結(jié)果表明，提取時(shí)間減小而提取溫度或料液比增大的同時(shí)，響應(yīng)曲面變化較平緩，此時(shí)影響不明顯；各因素軸向等高線橢圓程度不高，說明各因素交互作用影響不明顯；影響順序依次為：料液比>提取溫度>提取時(shí)間。

圖4 提取條件互作對(duì)PAB2含量的影響

2.3.3 最佳提取條件的確定與驗(yàn)證

由表4可知，按照理論條件提取獲得的原花青素提取物含量為5.05 mg/g。為驗(yàn)證上述參數(shù)的準(zhǔn)確性，并考慮到實(shí)際試驗(yàn)的可操作性，按照實(shí)際條件提取獲得的原花青素提取物含量為5.06 mg/g，與理論條件的相對(duì)偏差為0.198%。

表4 紫象草原花青素最佳提取條件的確定與驗(yàn)證

2.4 原花青素提取物含量測(cè)定結(jié)果

以最佳條件參數(shù)提取紫象草全株、莖、葉及皇竹草葉的原花青素，測(cè)定提取物PAB2、OPC及TP含量分別見圖5-a、圖5-b、圖5-c，紫象草葉提取物PB2、OPC、TP含量分別為19.26、187.44、594.24 mg/g，均顯著高于紫象草全株、莖及皇竹草葉(P<0.05)。

PAB2含量與OPC、TP含量相關(guān)性分析見表5，PAB2含量與TP含量呈顯著正相關(guān)(R2=0.94，P<0.05)。以上結(jié)果表明，以DMAC法測(cè)定的PAB2含量能夠很好地反映紫象草提取物OPC、TP含量。

圖5 原花青素提取物含量測(cè)定

表5 PAB2含量與OPC、TP含量的Person相關(guān)性系數(shù)

2.5 紫象草原花青素提取物體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

紫象草葉原花青素提取物含量最高，故研究了其對(duì)ABTS·、DPPH·、OH·清除能力的影響，分別見圖6-a、圖6-b、圖6-c。在濃度分別為3.125～200 mg/mL、0.2～200 mg/mL、0.195～25 mg/mL內(nèi)，ABTS·、DPPH·、OH·清除率均隨紫象草原花青素提取物濃度增加而增加；當(dāng)紫象草原花青素提取物濃度為200 mg/mL時(shí)，ABTS·、DPPH·清除率最高，分別為95.69%、96.79%，顯著高于3.125～50 mg/mL、0.2～50 mg/mL時(shí)(P<0.05)；當(dāng)紫象草原花青素提取物濃度為25 mg/mL時(shí)，OH·清除率最高，達(dá)90.04%，顯著高于0.195～12.5 mg/mL時(shí)(P<0.05)。

圖6 紫象草原花青素提取物體外抗氧化活性

3 討 論

3.1 紫象草原花青素的含量測(cè)定及提取條件的優(yōu)化

原花青素性質(zhì)活潑，組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜[16]，對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定的方法也比較多，目前常用的方法主要分為高效液相色譜(HPLC)法和分光光度法兩大類[17]，前者專一性好，但速度慢、成本高；后者包括丁醇-鹽酸法(Porter法)[18]、硫酸-香草醛法[19]等，所用測(cè)定儀器簡(jiǎn)單，速度快，但專一性差。DMAC是一種淡黃色、有微氨氣味的非質(zhì)子性高極性化合物。DMAC與原花青素的間苯三酚的親核位點(diǎn)結(jié)合，形成藍(lán)色產(chǎn)物，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定反應(yīng)后溶液在最大吸收峰處的OD值，即能快速測(cè)定原花青素含量[20]，以DMAC法測(cè)定山竹[15]及曼越橘[21]原花青素含量，結(jié)果專一性強(qiáng)、靈敏度高。選擇具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)品能影響DMAC法的準(zhǔn)確度，B型原花青素二聚體因其獨(dú)特的沒食子酸酯結(jié)構(gòu)發(fā)生?；磻?yīng)所引起的酚羥基增效效應(yīng)而具有較強(qiáng)的抗氧化清除自由基活性，而高聚體及A型原花青素二聚體由于不具備此結(jié)構(gòu)而生物活性較弱[22-23]。本試驗(yàn)以抗氧化活性最強(qiáng)的組分PAB2作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立DMAC法快速準(zhǔn)確測(cè)定紫象草原花青素提取物的含量，結(jié)果與采用商品試劑盒測(cè)定的TP、OPC含量相關(guān)性良好，表明DMAC法快速靈敏、專一性高，可以用于紫象草提取物中原花青素含量的測(cè)定。

目前植物中原花青素的提取主要采用超聲波、微波、酶和機(jī)械處理輔助的單溶劑和多溶劑萃取法[24-27]。原花青素富含的酚羥基結(jié)構(gòu)易溶于有機(jī)溶劑(如乙醇、丙酮)[28]；超聲波可以破壞植物細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)活性成分的快速溶出[29]，提高有機(jī)溶劑通過細(xì)胞膜的滲透性[30]，顯著縮短提取時(shí)間，超聲波輔助有機(jī)溶劑提取可顯著提高提取效率[31]。Martín-García等[32]采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取啤酒糟原花青素，在80%丙酮水溶液、超聲功率400 W、提取時(shí)間55 min的條件下獲得了最高含量的原花青素。本試驗(yàn)采用超聲波輔助酸性丙酮溶液萃取法提取紫象草原花青素，提取物含量隨料液比及溫度的增加而增加，這是因?yàn)樵ㄇ嗨嘏c酸性丙酮均屬極性物質(zhì)，提高料液比有助于增強(qiáng)植物細(xì)胞中原花青素等多酚活性物質(zhì)的溶解度[33]，由于超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)降低了分子水平上的暴露溫度[34]，故本試驗(yàn)在55 ℃低溫條件下提取即獲得了最高提取物含量；然而提取物含量隨提取時(shí)間的增加而減小，這是因?yàn)檩^長(zhǎng)時(shí)間的超聲波及水浴處理可能導(dǎo)致原花青素的降解[35]。Lv等[36]研究得到猴桃葉原花青素的最優(yōu)提取條件參數(shù)為：料液比30 mL/g、超聲功率200 W(70 ℃、15 min)，各因素影響順序依次為：溫度>料液比>時(shí)間。因?yàn)楸驹囼?yàn)采用丙酮作為提取劑，受制于丙酮溶液沸點(diǎn)較低，本試驗(yàn)僅在35～55 ℃內(nèi)展開研究，而原花青素在55～70 ℃內(nèi)并不發(fā)生降解，低溫范圍內(nèi)對(duì)于原花青素的溶解及提取效果不明顯，故本試驗(yàn)各因素影響順序依次為：料液比>溫度>時(shí)間。

3.2 紫象草葉原花青素提取物體外抗氧化活性

畜禽在生產(chǎn)過程中的多種因素都能夠引起動(dòng)物機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)，產(chǎn)生諸如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等[37]，從而造成機(jī)體損傷，影響動(dòng)物健康和動(dòng)物性產(chǎn)品品質(zhì)。原花青素的酚羥基結(jié)構(gòu)可與氧化物結(jié)合并清除自由基，自身則被氧化形成醌式結(jié)構(gòu)，醌式結(jié)構(gòu)通過親核加成反應(yīng)生成兒茶酸、焦酚結(jié)構(gòu)類似物，進(jìn)一步起到抗氧化作用，從而保護(hù)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子活性物質(zhì)不被氧化[38]。本試驗(yàn)通過芬頓(Fenton)反應(yīng)及氧化還原反應(yīng)體系生成穩(wěn)定存在的OH·、ABTS·、DPPH·，測(cè)定紫象草原花青素提取物的自由基清除能力，用于評(píng)估其抗氧化活性。余修亮等[39]研究發(fā)現(xiàn)，OPC含量為44.36 mg/g的蓮子殼原花青素提取物對(duì)DPPH·清除能力與維生素C接近、對(duì)ABTS·清除能力強(qiáng)于維生素C；本試驗(yàn)探究得到，紫象草原花青素提取物濃度為200 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、ABTS·清除率分別為95.69%、96.79%；紫象草原花青素提取物為25 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率為90.04%。由此可見，紫象草原花青素提取物能夠有效清除自由基，具有提高機(jī)體抗氧化活性、緩解氧化應(yīng)激的潛能。此外，原花青素的純度對(duì)抗氧化活性也有影響，汪玉玲等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在0～1.0 mg/mL濃度內(nèi)，青桑葚提取物及各純化組分對(duì)ABTS·、DPPH·清除能力的隨濃度增加而增加，且純度越高，清除自由基能力越強(qiáng)。雖然本試驗(yàn)并未對(duì)紫象草原花青素提取物進(jìn)行純化處理，提取物中可能存在可溶于有機(jī)溶劑的脂類、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等雜質(zhì)[41]，紫象草原花青素提取物的聚合度和各組分含量也有待進(jìn)一步分析，但是考慮到分離制備純品將增加生產(chǎn)成本，且粗提取物仍然具備良好的清除自由基活性，故本試驗(yàn)制備的紫象草原花青素提取物仍然具有開發(fā)為天然抗氧化飼料添加劑的潛力。

4 結(jié) 論

紫象草原花青素提取物的最優(yōu)制備條件參數(shù)為：料液比1∶110 g/mL、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間60 min，DMAC法測(cè)定此條件下提取物PAB2含量為5.06 mg/g。紫象草原花青素提取物濃度為200 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS·、DPPH·清除率分別為95.69%、96.79%，濃度為25 mg/mL時(shí)對(duì)OH·清除率為90.04%。