紫云英苷通過(guò)增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2基因表達(dá)修復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠肝臟損傷

張文天 吳秋雪 祝鍇燁 羅海靜 張珍珠 邵淑麗 張偉偉,2*

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾 161006；2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006)

適當(dāng)運(yùn)動(dòng)有助于身體健康[1]，但急性力竭運(yùn)動(dòng)使機(jī)體細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈?zhǔn)艿揭种?，從而ATP生成減少，分解增加，生成大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)反應(yīng)[2]。肝臟含有豐富的線(xiàn)粒體，因此是ROS攻擊的主要器官[3]。正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的ROS的生成和清除處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生ROS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)部清除ROS的酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)將發(fā)揮作用，例如，谷胱甘肽(glutathione，GSH)等可以中和氧自由基，減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷[4]。

清除ROS的酶促系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)等。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)一種重要的催化分解過(guò)氧化氫的酶，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[5]。GR是一種將氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized，GSSG)還原成GSH的酶。GSH是參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要還原劑，由γ-谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，以巰基還原(GSH)和二硫鍵氧化(GSSG)形式存在[6]。其中GSH是主要形式，具有清除自由基、解毒、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收等多種重要生理功能[7]。GSH含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素[8]。此外，谷氨酰半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)是GSH合成限速酶，由谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)組成，其表達(dá)受核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)的調(diào)控[9]。Nrf2是氧化應(yīng)激感受器，可以與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，當(dāng)GCLC表達(dá)降低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致GSH的合成減少，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)ROS清除能力的下降，引起氧化損傷。機(jī)體受到氧化損傷后，會(huì)自動(dòng)修復(fù)受到的損傷，而在修復(fù)過(guò)程中，GCLC與GCLM的表達(dá)都會(huì)升高，進(jìn)而GSH的表達(dá)也會(huì)升高[10]。

當(dāng)急性力竭運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的ROS超出機(jī)體的清除能力時(shí)，就會(huì)對(duì)機(jī)體特別是肝臟造成損傷。目前治療急性肝臟損傷的藥物有人參皂苷、蒲葵子、熊去膽堿膠囊[11]、雷公藤甲素[12]、糖皮質(zhì)激素、中藥復(fù)方861合劑等[13]。但這些藥物原材料稀有，且副作用大，因此尋找來(lái)源廣泛且治療效果好的藥物成為肝臟損傷研究的關(guān)鍵。

紫云英苷(astragalin,AG)是從百蕊草或杜仲等中草藥中提取的黃酮類(lèi)化合物，化學(xué)名稱(chēng)是山奈酚-3-O-葡萄糖苷，相對(duì)分子質(zhì)量為448.38。其常溫下呈黃色針晶狀，熔點(diǎn)218～220 ℃，沸點(diǎn)823.2 ℃(760 mmHg)，不溶于水，溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑[14]。研究表明，紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏性皮炎、提高機(jī)體免疫力等作用[15]。但紫云英苷對(duì)小鼠肝臟氧化損傷的修復(fù)作用效果如何尚不清楚。本試驗(yàn)以C57BL/6J雄性小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)急性力竭運(yùn)動(dòng)制備小鼠肝臟損傷模型，分別灌胃0.1 mL 50、100 mg/kg的紫云英苷后檢測(cè)小鼠肝臟組織氧自由基的清除能力、GSH含量及其相關(guān)酶的活性，同時(shí)檢測(cè)Nrf2基因以及Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因GCLC、GCLM的表達(dá)變化，初步探索紫云英苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠的肝臟損傷的修復(fù)能力，為肝臟損傷治療及紫云英苷的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：48只8周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗(yàn)開(kāi)始前，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周。對(duì)動(dòng)物的使用與飼養(yǎng)嚴(yán)格遵守國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定以及齊齊哈爾大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用條例。

試藥試劑：紫云英苷(純度為98%)購(gòu)自源葉生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，GSH、GSH-Px、GR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，Nrf2、GCLC、GCLM和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，二抗購(gòu)自LI-COR公司。

試驗(yàn)儀器：Spark10M多功能酶標(biāo)儀(Tecan,瑞士)、Z32HK高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Hermle,德國(guó))、Thermo Electron(-80 ℃)超低溫冰箱(Thermo,美國(guó))、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Eppendorf,德國(guó))、NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(jì)(Thermo,美國(guó))、電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

將48只8周齡雄性C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，基礎(chǔ)飼糧喂養(yǎng)，正常飲水，室溫環(huán)境生存，在試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行游泳測(cè)試。小鼠分組及急性力竭運(yùn)動(dòng)處理參照祝鍇燁等[26]的報(bào)道：將小鼠隨機(jī)分為4組，分別為DMSO組、力竭運(yùn)動(dòng)組、50 mg/kg BW紫云英苷組、100 mg/kg BW紫云英苷組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只。除DMSO組外，其余3組小鼠進(jìn)行一次性游泳4 h。2個(gè)紫云英苷組在力竭運(yùn)動(dòng)后分別灌胃0.1 mL由DMSO溶解的50 和100 mg/kg BW紫云英苷，力竭運(yùn)動(dòng)組在力竭運(yùn)動(dòng)后灌胃等量生理鹽水，DMSO組灌胃等量生理鹽水配制的0.1% DMSO。灌胃1 h后將小鼠斷頸處死后冰上解剖取肝臟，預(yù)冷生理鹽水洗去肝臟表面血液，濾紙吸干，液氮速凍后保存在-80 ℃直至分析。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2 小鼠肝臟中抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

從-80 ℃冰箱取出肝臟組織，剪取一定量肝臟組織于液氮中研磨成粉末，加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，用NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。取1 μg RNA樣品，按照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以各組cDNA為模板，β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。反應(yīng)體系為10 μL：TB Green Premix Ex TaqⅡ 5 μL，cDNA 1.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 2.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，得到Nrf2、GCLC、GCLM、β-actin mRNA的Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所需引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3.3 小鼠肝臟中抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定

從-80 ℃冰箱肝臟組織，剪取一定量肝臟組織于液氮中研磨成粉末，加入1 mL RIPA裂解液，按照RIPA裂解液(強(qiáng))說(shuō)明書(shū)提取蛋白質(zhì)，利用BAC法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，取10 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。然后采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的目的蛋白電轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用封閉液(含5%脫脂奶粉)孵育1 h后，加入用TBST按照1∶2 000稀釋的Nrf2、GCLC、GCLM和β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜；0.2% TBS-Tween洗膜3次，15 min/次；二抗室溫避光孵育1 h；0.2% TBS-Tween洗膜3次，每次15 min；Odyssey紅外熒光掃儀檢測(cè)條帶，并進(jìn)行灰度掃描，用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中·OH和清除能力的影響

表2 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中·OH和清除能力的影響

2.2 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中GSH含量的影響

紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中GSH含量的影響見(jiàn)表3。與DMSO組相比，力竭運(yùn)動(dòng)組小鼠肝臟中GSH含量降低27%(P<0.05)；與力竭運(yùn)動(dòng)組相比，灌胃濃度為50和100 mg/kg BW的紫云英苷均可提高力竭運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟中GSH含量，分別使GSH含量提高1.36(P<0.05)和2.21倍(P<0.01)。上述結(jié)果表明紫云英苷可顯著改善由力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠肝臟中GSH含量的降低。

表3 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中GSH含量的影響

2.3 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中GSH-Px和GR活性的影響

紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中GSH-Px和GR活性的影響見(jiàn)表4。與DMSO組相比，力竭運(yùn)動(dòng)組的小鼠肝臟中GSH-Px和GR活性分別降低32%(P<0.01)和37%(P<0.05)；與力竭運(yùn)動(dòng)組相比，灌胃濃度為50和100 mg/kg BW的紫云英苷均可提高小鼠肝臟中GSH-Px和GR活性，分別使GSH-Px活性提高1.54(P<0.01)和1.99倍(P<0.01)，GR活性提高1.42(P<0.01)和1.62倍(P<0.01)。

表4 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟GSH-Px和GR活性的影響

2.4 紫云英苷對(duì)小鼠肝臟中Nrf2、GCLC、GCLM基因和蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果(圖1-A)顯示，與DMSO組相比，力竭運(yùn)動(dòng)組小鼠肝臟中Nrf2和GCLM的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，GCLC的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)；與力竭運(yùn)動(dòng)組相比，灌胃濃度為50和100 mg/kg BW的紫云英苷均可使小鼠肝臟中Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)(圖1-A)。

Western blot結(jié)果(圖1-B、圖1-C)顯示，力竭運(yùn)動(dòng)組小鼠肝臟中Nrf2和GCLM的蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，GCLC的蛋白相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)；與力竭運(yùn)動(dòng)組相比，灌胃濃度為50和100 mg/kg BW的紫云英苷可使小鼠肝臟中Nrf2、GCLC、GCLM的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

GCLC：谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基glutamate-cysteine ligase catalytic subunit；GCLM：谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基glutamate-cysteine ligase modifier subunit；Nrf2：受核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2 nuclear factor E2 related factor 2；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；DMSO：DMSO組 DMSO group；EX：力竭運(yùn)動(dòng)組 exhaustive exercise group；EX+AG50：50 mg/kg BW紫云英苷組 50 mg/kg BW astragalin group；EX+AG100：100 mg/kg BW紫云英苷組 100 mg/kg BW astragalin group。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“ns”表示沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，標(biāo)注“*”表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注“**”表示差異極顯著(P<0.01)。Data columns with “ns” indicated no significant difference (P>0.05), with “*” indicated significant difference (P<0.05), and with “**” indicated extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

研究表明機(jī)體中主要存在2類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，一類(lèi)是酶抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、GSH-Px以及過(guò)氧化氫酶(CAT)等；另一類(lèi)是非酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，包括維生素D、維生素E、GSH、褪黑素、α-硫辛酸、類(lèi)胡蘿卜素以及微量元素銅、鋅、硒等[20-22]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可以催化GSH轉(zhuǎn)化成GSSG，使有毒的過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)過(guò)氧化氫的分解[23]。GSH是機(jī)體中重要的抗氧化劑與自由基清除劑，普遍存在于植物、微生物和所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，GSH可以作為GSH-Px催化反應(yīng)的底物，還原過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物，使機(jī)體內(nèi)的氧自由基維持在一個(gè)較低的水平，以免對(duì)機(jī)體造成損傷[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，力竭運(yùn)動(dòng)組小鼠肝臟中GSH含量比DMSO組小鼠顯著降低，同時(shí)力竭運(yùn)動(dòng)組小鼠肝臟中GSH-Px與GR活性相比DMSO組的小鼠也顯著或極顯著下降，說(shuō)明一次性游泳4 h的力竭運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟組織消耗了大量的GSH，產(chǎn)生了大量的ROS。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果可知，紫云英苷可通過(guò)上調(diào)Nrf2基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游的GCLC、GCLM基因表達(dá)，最終提高小鼠肝臟中GSH含量，增強(qiáng)小鼠肝臟的抗氧化能力，并在一定程度上修復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠肝臟損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，適量的紫云英苷可通過(guò)上調(diào)Nrf2以及其調(diào)控的下游因子GCLC和GCLM基因的表達(dá)在一定程度上修復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠肝臟損傷。