表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大腸桿菌誘導型奶牛乳腺上皮細胞炎性損傷的影響

徐天樂 朱 浩 劉 潤 梁 艷 曹海南 楊章平,*

(1.揚州大學農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國際聯(lián)合實驗室)，揚州 225000;2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225000)

乳腺炎、子宮炎和蹄葉炎是影響奶牛生產(chǎn)的3種常見疾病[1]。其中，乳腺炎直接影響奶牛的產(chǎn)奶能力和牛奶品質(zhì)，是人們一直關注的焦點[2]。乳腺炎一般是由細菌感染引起，根據(jù)細菌病原體的不同，將乳腺炎分為2種類型，即傳染性乳腺炎和環(huán)境性乳腺炎，這2種類型的乳腺炎分別由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染引起[3-4]。由大腸桿菌引起的奶牛臨床乳腺炎給世界各地的奶牛場造成了重大的奶產(chǎn)量損失和動物福利問題。脂多糖是大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌的細胞壁成分[5]。大量研究表明，革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖可以誘導奶牛乳腺上皮細胞發(fā)生炎癥反應以及氧化應激[6]。氧化應激和炎癥可以互相誘導激活，機體失衡產(chǎn)生的氧化應激不僅會損傷蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子，還會激活產(chǎn)生炎癥的轉錄因子，加重炎癥反應[7-8]。初步研究表明，脂多糖通過與Toll樣受體(TLR)4結合啟動細胞內(nèi)信號轉導，而TLR4的激活參與了一系列TLR信號級聯(lián)反應，最終介導轉錄因子核因子-κB(NF-κB)的激活，從而導致細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的產(chǎn)生[9]。

在奶牛的日常管理過程中，抗生素常作為治療乳腺炎的藥物，但如果大劑量使用抗生素會造成奶牛體內(nèi)有很多殘留，導致經(jīng)奶牛乳房擠下來的牛奶中通常會含有抗生素[10]。國內(nèi)飼料“禁抗令”全面施行之前，抗生素還作為飼料添加劑，用來預防疾病并促進乳畜生長，但這容易危害生態(tài)安全以及影響乳品質(zhì)量，牛奶中殘留的抗生素還會進入環(huán)境中造成污染，飲用殘留有抗生素的牛奶會引起人體過敏反應，導致腸道菌群失調(diào)以及免疫能力下降[11]。2020年，我國要求飼料端全面“無抗”，天然植物因其安全有效的優(yōu)勢成為了替代抗生素研究與應用的熱點[12]。植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對畜禽具有促生長、抑菌、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)控及調(diào)節(jié)腸道菌群等作用，是理想的抗生素替代品[13]。許多植物提取物，如植物精油也已經(jīng)被證明可以緩解奶牛乳腺上皮細胞的炎癥反應和氧化應激，起到保護乳腺的作用[14]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚的主要組成部分，具有抑菌、抗炎和抗氧化等功能[15-16]。EGCG在家禽生產(chǎn)中應用較多，是一種良好的飼料添加劑，可以改善雞蛋品質(zhì)，提高雞蛋的抗氧化能力以及提高肉雞的生產(chǎn)性能[17-18]。Xue等[19]研究表明，在肉仔雞飼糧中添加600 mg/kg EGCG，能夠顯著提高肉仔雞的體重、平均日增重和平均日采食量。但關于EGCG對奶牛乳腺上皮細胞炎癥的影響少見報道。因此，本試驗利用大腸桿菌建立奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應及氧化損傷模型，通過添加EGCG，分析EGCG對原代奶牛乳腺上皮細胞(pbMEC)的修復作用和調(diào)節(jié)機制，為EGCG在改善奶牛健康方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用pbMEC由揚州大學奶牛遺傳資源與健康創(chuàng)新團隊提供；EGCG購買于Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶和胎牛血清購買于Gibco公司；反轉錄試劑盒和熒光定量PCR檢測試劑盒購買于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；BeyoClickTM5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)-555細胞增殖檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、免疫熒光染色試劑盒、CCK-8細胞活力檢測試劑盒和抗體購買于上海碧云天生物技術有限公司；FuturePAGETM蛋白預制膠、快速轉移緩沖液和MOPS-SDS電泳緩沖液購買于南京艾思易生物科技有限公司；倒置熒光顯微鏡(DMi8)購買于德國徠卡公司，酶標儀(SPARK)購買于瑞士Tecan公司，蛋白印跡成像系統(tǒng)(FluorChem Q)購買于美國Protein Simple公司，實時熒光定量PCR儀(QuantStudio3)購買于美國賽默飛公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和傳代

試驗采用傳代2～5代的細胞，每24 h更換1次細胞培養(yǎng)液，當細胞密度達到80%～90%時，用胰蛋白酶消化；然后1 000×g離心3 min，棄上清液，將細胞接種在6孔板和96孔板上。

1.2.2 細胞活力測定

在pbMEC中加入不同濃度的EGCG[0(對照)、20、40、60、80和100 μmol/mL]培養(yǎng)12 h，每孔加入含10 μL CCK-8試劑的100 μL RPMI 1640培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后用酶標儀在450 nm處測量每孔的吸光度(OD)值。

1.2.3 試驗設計

根據(jù)前期實驗室研究成果，選用1×107CFU大腸桿菌構建乳腺上皮細胞炎癥模型。將培養(yǎng)好的細胞分為3個組，分別為對照組、大腸桿菌處理組(1×107CFU大腸桿菌處理細胞6 h)和EGCG+大腸桿菌處理組(先用60 μg/mL EGCG處理細胞24 h，再用1×107CFU大腸桿菌處理細胞6 h)，每組設3個重復。

1.2.4 EdU細胞增殖檢測

按照1.2.3步驟處理細胞，在6孔板中加入1 mL工作液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，隨后加入多聚甲醛室溫固定15 min；添加1 mL通透液通透15 min，每孔加入0.5 mL的Click反應液，避光孵育30 min后洗滌細胞；每孔加入1 mL Hoechst 33342反應液，避光孵育10 min；最后用倒置熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.5 MDA生成量檢測

按照1.2.3步驟處理細胞后，加0.5 mL提取液并混勻，取樣0.1 mL于離心管中，水浴40 min，冷卻并離心，96孔板中每孔加入250 μL反應液，酶標儀測定各孔在530 nm處的OD值。

1.2.6 活性氧(ROS)含量檢測

按照1.2.3步驟處理細胞后，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋2′,7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，去除細胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min；洗滌細胞3次，用倒置熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.7 RNA提取和實時熒光定量PCR

按照1.2.3步驟處理細胞，提取細胞RNA。采用2步法進行反轉錄，并將反轉錄得到的cDNA進行檢測。引物序列如表1所示，實時熒光定量PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.2.8 蛋白免疫印跡檢測

將細胞接種到6孔板并按照1.2.3步驟處理細胞，用裂解液提取細胞蛋白，并使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度；將各組的細胞濃度調(diào)節(jié)到相同水平后，使用預制膠進行電泳，并轉移到硝酸纖維素膜上；用牛血清白蛋白(BSA)封閉膜，隨后與一抗[TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、p65、磷酸化p65(p-p65)和GAPDH]孵育，在4 ℃下過夜，用TBST洗膜5～6次，每次5 min；然后用二抗搖動孵育2 h，并再用TBST洗滌5～6次，每次5 min；最后用蛋白印跡成像系統(tǒng)檢測條紋。

1.2.9 免疫熒光檢測

將細胞接種到6孔板并按照1.2.3步驟處理細胞，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，通透液處理10 min；加入封閉液并處理60 min，然后每孔加入一抗，4 ℃過夜孵育；用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的二抗，避光孵育2 h，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液對細胞核進行染色，每孔500 μL；室溫避光孵育并清洗，最后使用倒置熒光顯微鏡避光拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，結果以“平均值±標準差(mean±SD)”表示。

2 結果與分析

2.1 EGCG對pbMEC活力的影響

如圖1所示，用不同濃度EGCG處理pbMEC 12 h后，在80和100 μmol/mL EGCG處理下，pbMEC活力與對照組相比顯著下降(P<0.05)；而在20、40和60 μmol/mL EGCG處理下，pbMEC活力與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。因此，選用60 μmol/mL EGCG進行后續(xù)試驗。

數(shù)據(jù)柱標記不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Data columns marked with different letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC增殖的影響

采用EdU試劑盒并通過熒光顯微鏡觀察pbMEC增殖情況，如圖2所示，大腸桿菌處理組細胞增殖數(shù)量明顯少于對照組；EGCG+大腸桿菌處理組細胞增殖數(shù)量明顯多于大腸桿菌處理組。結果表明，EGCG對大腸桿菌抑制的細胞增殖有一定的保護作用。

2.3 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC MDA生成量的影響

EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC MDA生成量的影響如圖3所示，與對照組相比，大腸桿菌處理組細胞MDA生成量顯著提高(P<0.05)；與大腸桿菌處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細胞MDA生成量顯著降低(P<0.05)。

圖2 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC增殖的影響

2.4 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC ROS含量的影響

EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC ROS含量的影響如圖4所示，與對照組相比，大腸桿菌處理組熒光強度(ROS含量)明顯增強；與大腸桿菌處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組熒光強度明顯降低。

2.5 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC炎癥因子mRNA相對表達量的影響

EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC炎癥因子mRNA相對表達量的影響如圖5所示，與對照組相比，大腸桿菌處理組細胞IL-1β、TNF-α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和TLR4 mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)；與大腸桿菌處理處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細胞IL-1β、TNF-α、iNOS和TLR4 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。

2.6 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC NF-κB通路相關蛋白表達量的影響

EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC NF-κB通路相關蛋白表達量的影響如圖6所示，與對照組相比，大腸桿菌處理組細胞TLR4、p-p65和MyD88蛋白表達量顯著提高(P<0.05)；與大腸桿菌處理處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細胞TLR4、p-p65和MyD88蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。

圖3 EGCG對大腸桿菌處理的

圖4 EGCG對大腸桿菌處理的

2.7 p-p65在pbMEC胞質(zhì)和胞核中的表達

通過免疫熒光試驗檢測p-p65在pbMEC胞質(zhì)和胞核中的表達，如圖7所示，與對照組相比，大腸桿菌處理組細胞p-p65熒光強度明顯增強；與大腸桿菌處理處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細胞p-p65熒光強度明顯降低。

圖5 EGCG對大腸桿菌處理的pbMEC炎癥因子mRNA相對表達量的影響

E. coli：大腸桿菌 Escherichia coli；EGCG：表沒食子兒茶素沒食子酸酯 epigallocatechin gallate；TLR4：Toll樣受體4 Toll-like receptor 4；MyD88：髓樣分化因子88 myeloid differentiation factor 88；p-p65：磷酸化p65 phospho-p65；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。

圖7 p-p65在pbMEC胞質(zhì)和胞核中的表達

3 討 論

本研究通過EdU細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)，加入適宜濃度的EGCG后，受到大腸桿菌侵襲的pbMEC的增殖比例明顯提高。相關研究表明，大腸桿菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，其細胞壁特有的脂多糖已被證明可誘導pbMEC的炎癥和氧化應激[20]。隨著對植物提取物研究的深入，越來越多的活性物質(zhì)被用于探索抗氧化、抗炎和抗腫瘤等活性功能[21-22]，而EGCG作為茶多酚中最主要的活性物質(zhì)，已經(jīng)被證明具有抗炎和抗氧化功能。郭子玉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠通過與大腸桿菌結合，抑制大腸桿菌膜孔蛋白的功能，最終導致大腸桿菌細胞死亡。據(jù)此推測，EGCG對大腸桿菌誘導型奶牛乳腺上皮細胞炎性損傷具有一定的抑制作用。本研究結果發(fā)現(xiàn)，加入適宜濃度的EGCG可顯著降低大腸桿菌處理的pbMEC中TNF-α和IL-1βmRNA的表達。TNF-α是一種涉及到系統(tǒng)性炎癥的細胞因子，與大腸桿菌誘導型乳腺炎脂多糖休克有著密不可分的關系[24]。IL-1β是一種關鍵的促炎細胞因子，參與多種自身免疫性炎癥反應和多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡[25-26]。因此，加入適宜濃度的EGCG可以降低大腸桿菌誘導型奶牛乳腺上皮細胞炎性損傷，緩解細胞炎癥反應。

從上述結果可以看出，EGCG對大腸桿菌誘導的pbMEC炎癥有積極的作用，但研究表明，有效的抗炎癥治療策略不僅需要減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生，而且還需要減少炎癥誘導的氧化應激[27]。在炎癥刺激后，細胞產(chǎn)生過多的ROS和活性氮(RNS)，它們共同作用導致細胞損傷[28]。在細胞中，iNOS催化產(chǎn)生一氧化氮(NO)[29-30]。IL-1β被報道對iNOS的激活至關重要，隨著iNOS表達水平的升高，細胞內(nèi)NO含量增加，產(chǎn)生毒性物質(zhì)，引起亞硝化應激；同時，NO水平降低對細胞有利，可預防脂多糖產(chǎn)生的負面作用，減輕炎癥反應[31-32]。ROS的主要來源是細胞的線粒體呼吸鏈，線粒體受外界刺激后，產(chǎn)生過量ROS并且會對線粒體造成損傷，可能引發(fā)線粒體自噬[33]。RNS和ROS分子都是活性氧化還原自由基，可以互作形成額外的分子，如過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)，對細胞造成損傷。iNOS表達水平升高，局部劇增的NO易于被ROS氧化為RNS。RNS也被證明通過蛋白質(zhì)S-亞硝基化來調(diào)節(jié)參與ROS穩(wěn)態(tài)關鍵酶的活性[34-35]。MDA是脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物之一，其含量高低可以作為考察細胞受到損傷嚴重程度的指標之一[36]。而在本試驗中，大腸桿菌誘導的炎癥反應能顯著提高pbMEC中iNOSmRNA相對表達量、ROS含量和MDA生成量，而添加適宜濃度EGCG則可以緩解這種作用，這與上述研究結果基本一致。

此外，本試驗中受到大腸桿菌侵襲的pbMEC中TLR4的mRNA相對表達量和蛋白表達量顯著提高，而添加EGCG后，這一現(xiàn)象有所緩解。TLR4是一種跨膜蛋白，可以直接識別革蘭氏陰性細菌的脂多糖，并且能夠激活與適應性免疫有關的基因，其已被證明不僅是抵御病原體入侵的第一道防線，也是識別NF-κB信號通路上游配體的重要受體[37-38]。在細菌入侵期間，pbMEC通過增加TNF-α和IL-1β等促炎細胞因子分泌來觸發(fā)炎癥和免疫反應，這些細胞因子的激活需要TLR4對刺激的識別[39]。研究表明，當細胞產(chǎn)生炎癥反應時，NF-κB信號通路被激活，被激活的NF-κB信號可以通過磷酸化激活細胞內(nèi)的轉錄因子，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達，產(chǎn)生不同的生理反應[40]。MyD88是TLR信號通路中的一個關鍵接頭分子，在傳遞上游信息具有重要的作用[41]；而p65則是NF-κB家族成員之一，由NF-κB經(jīng)典通路激活[42]。為了進一步探明EGCG抑制炎性細胞因子產(chǎn)生是否與NF-κB信號通路有關，本試驗還檢測了p-p65、MyD88和p65這3個蛋白表達量，結果發(fā)現(xiàn)，受到大腸桿菌侵襲的pbMEC中p-p65和MyD88蛋白表達量較高，在添加適宜濃度的EGCG后，p-p65和MyD88蛋白表達量顯著降低。以上研究結果表明，適宜濃度的EGCG可以降低大腸桿菌誘導的TLR4活性升高，降低p65的磷酸化水平，并進一步抑制IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用，保護機體免受炎癥損傷。

4 結 論

EGCG能夠抑制大腸桿菌誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥因子以及NF-κB通路相關蛋白的表達，對乳腺上皮細胞炎癥反應以及氧化應激具有一定的緩解作用。