不同濃度短鏈脂肪酸對奶牛瘤胃上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)、緊密連接蛋白和G-蛋白偶聯(lián)受體41表達(dá)的影響

詹 康 譚德金 孟梓橦 馬曉宇 趙國琦

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

奶牛生產(chǎn)中，為提高產(chǎn)奶量，一般會在飼糧中添加高精料，但長時間飼喂高精料會誘發(fā)奶牛亞急性酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)和一些營養(yǎng)代謝性疾病，如瘤胃炎、蹄葉炎、間歇性腹瀉等，并導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降[1-3]，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其原因主要是飼喂高精料產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，導(dǎo)致瘤胃pH急劇下降和微生物解體并釋放大量脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、組胺和細(xì)菌抗原肽物質(zhì)，引起奶牛系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[4]。目前，SARA主要有3種學(xué)說，包括短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)、乳酸和內(nèi)毒素中毒學(xué)說，其中比較接受的是SCFAs中毒學(xué)說[5]。

SCFAs是瘤胃內(nèi)微生物發(fā)酵飼糧中碳水化合物產(chǎn)生的含有2～6個碳原子的脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，約占總揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)的95%[6]。SCFAs能夠被瘤胃上皮組織通過簡單擴(kuò)散或相關(guān)的SCFAs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收進(jìn)入血液[7-8]。之前的研究表明，SCFAs能調(diào)節(jié)瘤胃上皮的炎癥反應(yīng)[9]。研究顯示，濃度為5～40 mmol/L的SCFAs能夠促進(jìn)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞(bovine rumen epithelial cells，BRECs)中促炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)以及趨化因子CC趨化因子20(CCL20)、CXC趨化因子2(CXCL2)、CXC趨化因子3(CXCL3)和CXC趨化因子8(CXCL8)的表達(dá)[10]。然而，目前并未見在SARA條件下SCFAs濃度對BRECs炎癥反應(yīng)和瘤胃上皮屏障影響的研究。泌乳中期奶牛飼喂正常飼糧時，奶牛瘤胃液中SCFAs濃度在80 mmol/L左右。SARA條件下，奶牛瘤胃液中SCFAs濃度一般在100 mmol/L[11]。奶牛在SARA條件下能引起瘤胃上皮炎癥反應(yīng)和破壞瘤胃上皮的屏障功能。因此，我們假設(shè)高濃度的SCFAs能促進(jìn)瘤胃上皮的促炎癥反應(yīng)和破壞瘤胃上皮屏障功能。

SCFAs刺激乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)能夠顯著加強(qiáng)p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的激活，而添加200 ng/mL的百日咳毒素與BMECs孵育之后，結(jié)合和抑制了細(xì)胞的Gi/o家族蛋白，這個結(jié)果暗示SCFAs刺激BMECs的炎癥反應(yīng)受到了Gi/o家族蛋白的調(diào)控[12]。之前的研究已經(jīng)報道，G-蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41，GPR41)介導(dǎo)SCFAs調(diào)控BRECs炎癥反應(yīng)[9]。SCFAs通過激活小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的GPR41和G-蛋白偶聯(lián)受體43(G protein-coupled receptor 43，GPR43)來積極響應(yīng)免疫應(yīng)答并激活p38和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(pERK1/2)MAPK信號通路，從而介導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[13]。隨著SCFAs濃度(5～40 mmol/L)逐漸升高，GPR41表達(dá)量也逐漸增加[10]，然而，SARA條件下SCFAs濃度對GPR41表達(dá)的影響仍未知。之前的研究中，GPR41和GPR43作為SCFAs的受體已經(jīng)被證明[14]，并且GPR41已經(jīng)被證明能夠在BRECs中表達(dá)[15]，但未檢測到GPR43在BRECs表達(dá)[9]。SARA條件下產(chǎn)生高濃度的SCFAs對BRECs免疫反應(yīng)、緊密連接蛋白和GPR41表達(dá)的相關(guān)研究還未見報道。因此，本試驗?zāi)康氖茄芯坎煌瑵舛萐CFAs對BRECs免疫反應(yīng)、緊密連接蛋白和GPR41表達(dá)的影響，旨在理解GPR41在BRECs炎癥反應(yīng)調(diào)控中的作用，這可為理解瘤胃上皮炎癥反應(yīng)的潛在機(jī)制帶來新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)磷酸鹽緩沖液(PBS)和胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品；乙酸、丙酸、丁酸、青霉素、鏈霉素和乙二胺四乙酸(EDTA)為美國Sigma公司產(chǎn)品；熒光定量96孔板和8連管為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 BRECs培養(yǎng)

BRECs來自于揚(yáng)州大學(xué)動物培養(yǎng)物保存與應(yīng)用研究所(Institute of Animal Culture Collection and Application，YangzhouUniversity，IACCA)。用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)BRECs，待細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)瓶70%生長面積，用0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化細(xì)胞，放置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育3 min，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞開始發(fā)亮并從瓶底脫落，拍打培養(yǎng)瓶數(shù)次。如果還有部分BRECs未從培養(yǎng)瓶底部脫落，再放置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育2 min，用力拍打培養(yǎng)瓶數(shù)次，直至細(xì)胞全部脫落。用5 mL含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，傳至3個25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度再次達(dá)到培養(yǎng)瓶80%生長面積，這一過程需要3 d。

1.2.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)4個試驗組，在培養(yǎng)基中分別添加20、50、100和150 mmol/L SCFAs培養(yǎng)BRECs 24 h。培養(yǎng)24 h之后，細(xì)胞被收集提取總RNA。每組設(shè)3個重復(fù)。20 mmol/L SCFAs由12 mmol/L乙酸、5 mmol/L丙酸和3 mmol/L丁酸組成。50 mmol/L SCFAs由30 mmol/L乙酸、12.5 mmol/L丙酸和7.5 mmol/L丁酸組成。100 mmol/L SCFAs由60 mmol/L乙酸、25 mmol/L丙酸和15 mmol/L丁酸組成。150 mmol/L SCFAs由90 mmol/L乙酸、37.5 mmol/L丙酸和 22.5 mmol/L丁酸組成。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA

按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，試驗于冰上操作，反轉(zhuǎn)錄體系由500 ng總RNA、2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix和無RNA酶水組成，總體積為10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s。

1.2.4 熒光定量PCR

PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Kit 10 μL、上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板100 ng和滅菌蒸餾水，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品3個重復(fù)且使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，隨后在凝膠成像儀中觀察PCR產(chǎn)物。熒光定量PCR引物在表1中列出。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)模塊進(jìn)行單因素方差分析，顯著性檢驗應(yīng)用LSD法進(jìn)行。P<0.10表示為差異有顯著趨勢，P<0.05表示差異顯著。相關(guān)性使用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行分析。相關(guān)系數(shù)用r表示，r>0為正相關(guān)，r<0為負(fù)相關(guān)；|r|越接近1，相關(guān)性越強(qiáng)，|r|越接近0，相關(guān)性越弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度SCFAs對促炎癥因子表達(dá)的影響

由圖1可知，與添加20和50 mmol/L SCFAs時相比，添加100和150 mmol/L SCFAs時促炎癥因子IL-1β的mRNA相對表達(dá)量并未發(fā)現(xiàn)顯著改變(P>0.05)，但TNF-α的mRNA相對表達(dá)量被顯著提高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。Data columns with different letters mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 不同濃度SCFAs對趨化因子基因表達(dá)的影響

由圖2-A和圖2-B可知，與添加20和50 mmol/L SCFAs時相比，添加100 mmol/L SCFAs時CCL20和CXCL2的mRNA相對表達(dá)量被顯著上調(diào)(P<0.05)，然而，添加150 mmol/L SCFAs時CCL20和CXCL2的mRNA相對表達(dá)量與添加100 mmol/L SCFAs時相比被顯著下調(diào)(P<0.05)。由圖2-C、圖2-D和圖2-E可知，隨著SCFAs濃度的增加，CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達(dá)量逐漸下調(diào)；更為重要的是，添加150 mmol/L SCFAs時，CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達(dá)量最低。

圖2 不同濃度SCFAs對趨化因子表達(dá)的影響

2.3 不同濃度SCFAs對GPR41和緊密連接蛋白表達(dá)的影響

由圖3-A可知，隨著SCFAs濃度從20 mmol/L上升至100 mmol/L，GPR41的mRNA相對表達(dá)量被逐漸上調(diào)。SCFAs濃度為100 mmol/L時，GPR41的mRNA相對表達(dá)量顯著高于SCFAs濃度為20和50 mmol/L時(P<0.05)；然而，SCFAs濃度為150 mmol/L時，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與SCFAs濃度為100 mmol/L時相比并沒有發(fā)生顯著改變(P>0.05)。SCFAs濃度為150 mmol/L時，緊密連接蛋白閉合蛋白-1(Claudin-1)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的mRNA相對表達(dá)量最低(圖3-C和圖3-D)，且顯著低于SCFAs濃度為20和50 mmol/L時(P<0.05)。

圖3 不同濃度SCFAs對GPR41和緊密連接蛋白表達(dá)的影響

2.4 BRECs中GPR41與免疫細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)分析

由圖4可知，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與促炎癥因子TNF-α的mRNA相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。然而，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與趨化因子CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖4 BRECs中GPR41 mRNA相對表達(dá)量與免疫細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量之間的相關(guān)性

2.5 BRECs中GPR41與緊密連接蛋白的關(guān)聯(lián)分析

由圖5可知，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)趨勢(0.05≤P<0.10)。

圖5 BRECs中GPR41 mRNA相對表達(dá)量與緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量之間的相關(guān)性

3 討 論

長期飼喂高精料飼糧會誘發(fā)奶牛SARA營養(yǎng)代謝病，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)有機(jī)酸大量累積和瘤胃pH急劇下降，瘤胃含大量H+，從而改變瘤胃內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，打破瘤胃菌群結(jié)構(gòu)平衡，影響瘤胃微生物區(qū)系多樣性并誘發(fā)微生物解體釋放大量細(xì)菌抗原肽和LPS等促炎癥因子，破壞瘤胃上皮的免疫屏障功能，引起奶牛瘤胃上皮炎癥反應(yīng)以及機(jī)體的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[16]。奶牛SARA條件下，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的有機(jī)酸大部分是SCFAs，因此，SCFAs是誘發(fā)奶牛瘤胃上皮促炎癥反應(yīng)的重要因素。SARA條件下，奶牛瘤胃液中SCFAs濃度一般在100 mmol/L，有時甚至更高[11]。本試驗結(jié)果證明，100和150 mmol/L的SCFAs能誘導(dǎo)BRECs的促炎癥反應(yīng)，抑制趨化因子表達(dá)和瘤胃宿主的免疫應(yīng)答，減少緊密連接蛋白的表達(dá)，破壞瘤胃上皮的屏障功能。

在現(xiàn)代奶牛生產(chǎn)中，為提高產(chǎn)奶量，通常使用高精料飼糧，然而長時間飼喂高精料會誘發(fā)瘤胃SARA。目前，SARA主要有3種學(xué)說，包括SCFAs、乳酸和內(nèi)毒素中毒學(xué)說。目前研究較多的是SCFAs中毒學(xué)說。研究顯示，長時間飼喂高精料產(chǎn)生大量有機(jī)酸，誘發(fā)瘤胃上皮促炎癥反應(yīng)，增加瘤胃上皮的通透性[17]。此外，SARA條件下產(chǎn)生更多的SCFAs，激活MAPK和核因子-κB(NF-κB)信號通路，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃上皮促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)[11]。隨著SCFAs濃度的增加，能夠激活BRECs中促炎癥因子TNF-α表達(dá)，尤其是SCFAs濃度達(dá)到150 mmol/L時，BRECs中促炎癥因子TNF-α的mRNA相對表達(dá)量最高。上述結(jié)果表明，高濃度SCFAs能誘導(dǎo)瘤胃上皮的促炎癥反應(yīng)。之前的研究也顯示，低濃度的SCFAs顯著上調(diào)大部分CCL型和CXCL型趨化因子的表達(dá)，加強(qiáng)瘤胃上皮免疫應(yīng)答反應(yīng)[9]。趨化因子的主要作用是趨化免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到達(dá)組織受感染的部位進(jìn)行免疫應(yīng)答和促進(jìn)殺傷細(xì)胞進(jìn)行加工和處理抗原[18]。值得注意的是，添加150 mmol/L SCFAs孵育BRECs時，CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達(dá)量最低，這表明高濃度SCFAs減少BRECs中趨化因子的表達(dá)，抑制瘤胃上皮的免疫應(yīng)答。因為趨化因子表達(dá)量的增加能夠進(jìn)一步促進(jìn)免疫細(xì)胞趨化至瘤胃免疫層來加工處理抗原肽。

奶牛瘤胃上皮含有許多屏障層特性，包括角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層，這4層相互作用和交叉聯(lián)系，在宿主和瘤胃微生物之間建立屏障保護(hù)，維持瘤胃穩(wěn)態(tài)。緊密連接蛋白位于瘤胃上皮的中間層，對于瘤胃上皮細(xì)胞的分化、調(diào)控上皮屏障的間隙和阻止內(nèi)毒素移位至血液至關(guān)重要[19-20]。緊密連接蛋白主要由閉合蛋白(Claudins)、Occludin和ZO-1組成，它們與細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性密切相關(guān)[21]。高精料飼糧飼喂條件下抑制Claudins、Occludin和ZO-1的表達(dá)，并引起瘤胃上皮促炎癥因子TNF-α的表達(dá)，因此，瘤胃上皮緊密連接蛋白的穩(wěn)定與瘤胃上皮免疫屏障對奶牛健康具有至關(guān)重要的作用[22]。本試驗結(jié)果顯示，SCFAs濃度為150 mmol/L時，緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相對表達(dá)量顯著低于SCFAs濃度為20和50 mmol/L時且此時表達(dá)量最低，結(jié)果證明，高濃度的SCFAs能破壞BRECs的免疫屏障功能。SCFAs濃度由20 mmol/L增加至100 mmol/L，BRECs中GPR41的表達(dá)被激活。但是，SCFAs濃度由100 mmol/L增加至150 mmol/L時，BRECs中GPR41的mRNA相對表達(dá)量并沒有被改變。此外，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與促炎癥因子TNF-α的mRNA相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)；然而，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與趨化因子CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)；同時，GPR41的mRNA相對表達(dá)量與緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)趨勢。以上結(jié)果表明，SCFAs通過GPR41負(fù)調(diào)控BRECs的中趨化因子和緊密連接蛋白的表達(dá)。

4 結(jié) 論

100和150 mmol/L的SCFAs能誘導(dǎo)BRECs的促炎癥反應(yīng)，抑制趨化因子表達(dá)和免疫反應(yīng)，減少緊密連接蛋白的表達(dá)，破壞瘤胃上皮的免疫屏障功能。