不同比表面積玉米秸稈營養(yǎng)物質(zhì)降解及瘤胃微生物黏附特性的研究

楊大盛 尹夢(mèng)潔 駱東梅 汪水平 譚支良 湯少勛*

(1. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；2.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 402460；3.廣西揚(yáng)翔股份有限公司，貴港 537100)

粗飼料是反芻動(dòng)物飼糧最重要的組成成分，提高粗飼料的利用率對(duì)提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能、降低飼料成本具有重要意義。粗飼料在瘤胃被降解的首要條件是與微生物或酶進(jìn)行接觸，反芻動(dòng)物瘤胃粗飼料主要依靠瘤胃固相微生物降解。瘤胃微生物可在底物表面形成微生物膜，因此，底物表面的微生物酶與瘤胃液中的酶相比活性更高且不易被瘤胃液稀釋。研究表明，植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多糖降解酶在瘤胃內(nèi)容物3部分(瘤胃液相降解酶∶固相易被洗下降解酶∶固相不易被洗下降解酶)中的比活力為1.0∶2.0∶4.6[1]。這意味著在固相食糜表面不易洗下的酶越多，則飼料纖維的降解率越高。瘤胃微生物對(duì)飼糧降解利用不僅與飼糧化學(xué)組成(即營養(yǎng)成分)有關(guān)，而且與飼糧顆粒的物理化學(xué)特性有關(guān)，如單位質(zhì)量飼糧顆粒的表面積[即比表面積(specific surface area，SSA)]越大，意味著可供微生物附著的可降解位點(diǎn)也越多。高巍[2]研究發(fā)現(xiàn)，纖維降解菌的黏附數(shù)量和木聚糖酶活性隨飼糧表面積增加而增加。劉勇等[3]研究發(fā)現(xiàn)，提高稻草中性洗滌纖維比表面積可有效提高稻草纖維物質(zhì)消失率。Weimer等[4]認(rèn)為，纖維素降解速率隨纖維素比表面積增加而升高。減小粗飼料顆粒會(huì)增加其比表面積，從而增加纖維分解菌及酶的作用面積，促進(jìn)纖維物質(zhì)的降解[5]。但底物比表面積增加或減少后，黏附在底物表面的微生物種類與組成會(huì)發(fā)生什么變化目前并不清楚。因此，本研究旨在探索玉米秸稈比表面積變化對(duì)其營養(yǎng)物質(zhì)降解和瘤胃微生物在玉米秸稈表面黏附特性的影響，初步揭示底物比表面積影響底物降解特性的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所選材料為秋收去除玉米籽實(shí)后的秸稈。玉米秸稈帶回實(shí)驗(yàn)室后切成2～4 cm長(zhǎng)，65 ℃烘干后粉碎并測(cè)定其營養(yǎng)物質(zhì)含量，以干物質(zhì)(DM)為基礎(chǔ)，玉米秸稈粗蛋白質(zhì)(CP)含量為6.29%，中性洗滌纖維(NDF)含量為67.5%，酸性洗滌纖維(ADF)含量為41.4%。粉碎后的玉米秸稈過60目篩，分別取60目上和60目下的玉米秸稈采用比表面儀(Quadrasorb SI，美國康塔儀器公司)測(cè)定其比表面積，60目上和60目下的玉米秸稈比表面積分別為0.664和1.135 m2/g。

1.2 尼龍袋試驗(yàn)與樣品采集

選用3頭成年去勢(shì)、體況良好并裝有永久性瘤胃瘺管的瀏陽黑山羊[體重(20.00±2.20) kg]作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼糧由玉米秸稈和精料補(bǔ)充料組成，精粗比為40∶60，每天飼喂精料200 g，粗料300 g，自由飲水。

分別準(zhǔn)確稱取3 g(精確到0.000 1 g)2種比表面積的玉米秸稈，裝入尼龍袋中(孔徑35 μm，規(guī)格6 cm×12 cm)，每頭羊每個(gè)時(shí)間點(diǎn)作2個(gè)平行。將尼龍袋綁在塑料管上，一次性將全部尼龍袋投入瘤胃中，分別于0、6、12、24、36、48、72 h取出尼龍袋，用清水沖掉表面的瘤胃食糜，再用洗衣機(jī)洗滌8 min；將沖洗干凈的尼龍袋于65 ℃烘干48 h，取出稱重，裝入樣品袋常溫保存，用以測(cè)定營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率。以相同的試驗(yàn)材料與瘺管羊再開展1次尼龍袋試驗(yàn)，分別于0、1、4、8、12、24、48 h取出尼龍袋，用以采集瘤胃固相緊密黏附微生物樣品。參照Chen等[6]的方法收集瘤胃固相食糜。尼龍袋取出后迅速置于裝有4 ℃生理鹽水并滅菌的500 mL三角瓶中。搖床振蕩2 min，轉(zhuǎn)數(shù)200 r/min，倒出渾濁的生理鹽水，再加入4 ℃生理鹽水，繼續(xù)振蕩，直至加入的生理鹽水振蕩后仍然清澈為止。取出尼龍袋，并去除多余液體，切記不要用力搓揉。打開尼龍袋，用滅菌稱量勺將剩余食糜轉(zhuǎn)移至50 mL無菌無酶離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存。參照王加啟[7]的方法洗脫瘤胃固相微生物。取2 g固相食糜，加入20 mL 15%的吐溫80，0 ℃振蕩2.5 h，取出后靜置5 min，取上清2 mL用于分析瘤胃固相緊密黏附微生物數(shù)量。

1.3 樣品測(cè)定

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)含量的測(cè)定

按照張麗英[8]的方法測(cè)定DM、CP含量；按Hall等[9]方法使用Fi-bretherm FT12全自動(dòng)纖維儀(Gerhardt Analytical Systems，德國)測(cè)定NDF和ADF含量。

1.3.2 瘤胃微生物熒光定量分析

參照Yu等[10]的方法提取DNA，引物序列如表1所示。參照焦金真等[15]的方法進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，之后進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)體系：SYBR Green Ⅰ熒光染料預(yù)混試劑5 μL，ROX 0.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，質(zhì)粒DNA模板或樣品DNA模板1 μL(DNA模板濃度稀釋到10 ng/L左右)，牛血清白蛋白0.05 μL和滅菌雙蒸去離子水3.35 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s并采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。按儀器操作說明選擇熔解曲線分析，60 ℃升至95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，自動(dòng)采集熒光。

1.3.3 瘤胃微生物16S rDNA測(cè)序

16S rDNA擴(kuò)增選擇區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)，使用通用引物，并在通用引物的5’端加上適合MiSeq PE300測(cè)序的index序列和接頭序列，完成特異性融合引物的設(shè)計(jì)。正向引物(5′—3′)：CTACGGGNGGCWGCAG(F)和反向引物(5′—3′)：GACTACHVGGGTWTCTAAT(R)。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用諾唯贊的Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。利用Fragment Analyzer進(jìn)行PCR產(chǎn)物文庫質(zhì)檢。文庫質(zhì)檢合格后，根據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用QIAquick膠回收試劑盒(QIAGEN，美國)，對(duì)混合后文庫進(jìn)行切膠純化(切膠范圍：500～750 bp)。利用Fragment Analyzer和Applied Biosystems QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器進(jìn)行文庫質(zhì)檢及定量。使用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

去除測(cè)序結(jié)果reads中N堿基比例大于10%的序列和低質(zhì)量序列，用Flash1.2.11[16]進(jìn)行reads拼接，采用Qime 1.9.1進(jìn)行tags質(zhì)控過濾，再與Glod database(r20110519)數(shù)據(jù)庫對(duì)比(UCHIME algorithm)去嵌合體處理，根據(jù)barcode確定對(duì)應(yīng)樣品，去除barcode和引物序列。利用Mothurv 1.39.1軟件去冗余處理(https://www.mothur.org/)，計(jì)算tags豐度。按照相似度大于97%用Uparse(usearch v9.2.645)[17]將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，使用RDP方法將該代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種歸類。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

根據(jù)尼龍袋試驗(yàn)測(cè)定的營養(yǎng)物質(zhì)含量結(jié)果，玉米秸稈各營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的降解率(P)計(jì)算公式如下：

P(%)=[(降解前營養(yǎng)物質(zhì)含量-降解后營養(yǎng)物質(zhì)含量)/降解前營養(yǎng)物質(zhì)含量]×100。

采用Orskov方程進(jìn)行擬合：

P=a+b×(1-ec×t)[18]；各營養(yǎng)物質(zhì)有效降解率(effective degradability，ED)計(jì)算公式如下：

ED=a+b×[c/(c+Kp)][7]。

式中：a為當(dāng)t=0時(shí)的截距，為快速降解部分(%)；b為慢速降解部分(%)；c為慢速降解部分的降解速率常數(shù)(%/h)；t為瘤胃發(fā)酵時(shí)間(h)；Kp為瘤胃食糜的外流速度，在本研究中取值為Kp=0.036%/h。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用NLREG(V5.4)軟件計(jì)算玉米秸稈營養(yǎng)物質(zhì)降解參數(shù)，采用SPSS 19.0一般線性模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于尼龍袋降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)模型中比表面積為固定效應(yīng)，動(dòng)物為隨機(jī)因子。對(duì)于微生物數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)模型中包括比表面積、發(fā)酵時(shí)間以及二者的交互作用，其中發(fā)酵時(shí)間作為重復(fù)測(cè)量因素，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈瘤胃降解模型參數(shù)

由表2可知，2種比表面玉米積秸稈間DM和NDF的慢速降解部分及降解速率常數(shù)，以及CP的降解動(dòng)力學(xué)各參數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。比表面積高的玉米秸稈DM和NDF的快速降解部分比低比表面積玉米秸稈極顯著提高(P<0.01)，提高玉米秸稈比表面積時(shí)，DM和NDF的有效降解率極顯著提高(P<0.01)。

表2 比表面積對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解模型參數(shù)的影響

2.2 瘤胃微生物黏附數(shù)量

由表3可知，2種比表面積玉米秸稈間表面黏附的總細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌、厭氧真菌及黃色瘤胃球菌的黏附數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。增加玉米秸稈比表面積極顯著提高白色瘤胃球菌、反芻獸新月單胞菌及嗜淀粉瘤胃桿菌的黏附數(shù)量(P<0.01)，但顯著降低產(chǎn)琥珀酸絲桿菌的黏附數(shù)量(P<0.05)；玉米秸稈比表面積和發(fā)酵時(shí)間對(duì)反芻獸新月單胞菌的黏附數(shù)量有極顯著交互作用(P<0.01)。由圖1可知，發(fā)酵8 h之前，反芻獸新月單胞菌在比表面積較小的玉米秸稈表面的黏附數(shù)量一直處于增加狀態(tài)，而在比表面積較高的玉米秸稈表面的黏附數(shù)量在發(fā)酵4 h時(shí)達(dá)到最高，然后開始降低；發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物黏附數(shù)量均有極顯著影響(P<0.01)。由圖2可知，發(fā)酵48 h內(nèi)，總細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌、厭氧真菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲桿菌及嗜淀粉瘤胃桿菌在玉米秸稈表面黏附數(shù)量都隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在24 h時(shí)黏附細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高。

2.3 OTU多樣性分析

由圖3可知，比表面積較低(SSA1)的玉米秸稈與和比表面積較高(SSA2)的玉米秸稈共有OTU數(shù)1 148個(gè)，較低比表面積玉米秸稈1 195個(gè)，較高比表面積玉米秸稈1 150個(gè)(圖3-A)。主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)，較低比表面積玉米秸稈與較高比表面積玉米秸稈間表面黏附的瘤胃細(xì)菌數(shù)量無明顯差異(圖3-B)。

2.4 玉米秸稈表面菌群多樣性

由表4可知，提高玉米秸稈比表面積顯著降低玉米秸稈表面微生物的Chao1指數(shù)(P<0.05)，但對(duì)香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)無顯著影響(P>0.05)；發(fā)酵時(shí)間對(duì)Chao1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)有顯著影響(P<0.05)。由圖4可知，發(fā)酵48 h內(nèi)，Chao1指數(shù)在發(fā)酵4 h時(shí)達(dá)到最高，隨后開始下降。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，香農(nóng)指數(shù)在發(fā)酵4 h達(dá)到最高，隨后下降，并在12 h達(dá)到最低，隨后又開始上升。

由圖5可知，對(duì)于玉米秸稈表面黏附微生物的β多樣性，主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果表明，2種比表面積間無明顯差異。

表3 玉米秸稈比表面積對(duì)微生物黏附數(shù)量的影響

圖1 玉米秸稈比表面積及發(fā)酵時(shí)間對(duì)反芻

2.5 玉米秸稈表面微生物相對(duì)豐度

由圖6可知，微生物屬水平PCA表明，2種比表面積玉米秸稈屬水平微生物組成存在明顯差異。

由表5可知，提高玉米秸稈比表面積可顯著或極顯著提高解琥珀酸弧菌屬(P<0.01)、鏈球菌屬(P<0.05)相對(duì)豐度，顯著或極顯著降低纖維桿菌屬(P<0.01)、密螺旋體屬(P<0.01)、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬(P<0.05)和瘤胃桿菌屬(P<0.01)的相對(duì)豐度。發(fā)酵時(shí)間對(duì)依賴桿菌屬(P<0.01)、解琥珀酸弧菌屬(P<0.01)、瘤胃桿菌屬(P<0.05)、普雷沃氏菌屬(P<0.05)、密螺旋體屬(P<0.01)、瘤胃球菌屬(P<0.01)、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬(P<0.01)以及其他菌屬(P<0.01)的相對(duì)豐度有顯著或極顯著影響。玉米秸稈比表面積及發(fā)酵時(shí)間對(duì)普雷沃氏菌屬、解琥珀酸弧菌屬、密螺旋體屬、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬及其他菌屬的相對(duì)豐度有顯著的互作影響(P<0.05)。

3 討 論

粗飼料在反芻動(dòng)物咀嚼和反芻過程中進(jìn)行物理破碎，同時(shí)食糜在瘤胃中經(jīng)微生物發(fā)酵以提高其消化率。研究表明，在以狗牙根為唯一干草源時(shí)，其瘤胃上層中42%左右的飼糧顆粒大小在0.125～1.000 mm，10%左右的飼糧顆粒大小在0.125 mm以下，顆粒大小在1.000～4.000 mm的占24%左右[19]?；诖耍狙芯繉暭Z顆粒分別設(shè)為60目以上(>0.25 mm)和60目以下(<0.25 mm)。底物顆粒越小，其比表面積越大，同時(shí)其表面吸附能力越強(qiáng)，黏附位點(diǎn)與酶解位點(diǎn)越多，越有利于瘤胃微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的降解[3]。劉勇等[3]研究發(fā)現(xiàn)，提高稻草NDF的比表面積可有效提高稻草纖維物質(zhì)的降解率。Weimer等[4]認(rèn)為，纖維素降解速率隨比表面積增加而增加。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物黏附數(shù)量的影響

SSA1:比表面積為0.664 m2/g；SSA2:比表面積為1.135 m2/g。SSA1: specific surface area was 0.664 m2/g；SSA2: specific surface area was1.135 m2/g.

表4 玉米秸稈比表面積對(duì)微生物alpha多樣性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，增加玉米秸稈的比表面積可以提高玉米秸稈DM、NDF、CP的瘤胃降解率。微生物對(duì)底物的降解，其本質(zhì)還是微生物酶的降解。高巍[2]研究發(fā)現(xiàn)，增加植物飼料比表面積，可提高纖維降解菌的黏附數(shù)量與木聚糖酶的活性。Miron等[5]認(rèn)為，降低飼糧顆粒大小，可增加其比表面積，飼糧顆粒表面供纖維分解菌及酶作用的有效面積也越大，有利于微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的降解。當(dāng)瘤胃中降解細(xì)胞壁的微生物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，飼糧的消化過程就主要受飼糧顆粒表面可供微生物定植和侵襲面積的限制[20]。由此可見，增加玉米秸稈比表面積對(duì)其瘤胃降解性能的促進(jìn)作用，可能與微生物的黏附和酶解位點(diǎn)增加有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，增加玉米秸稈的比表面積可增加白色瘤胃球菌、反芻獸新月單胞菌、嗜淀粉瘤胃桿菌的黏附數(shù)量。Miron等[5]認(rèn)為，粗飼料顆粒越小，其比表面積就越大，粗飼料顆粒表面供纖維分解菌及酶作用的有效面積也越大，進(jìn)而更有利于纖維物質(zhì)的降解。白色瘤胃球菌、反芻獸新月單胞菌、嗜淀粉瘤胃桿菌等細(xì)菌是瘤胃降解粗飼料的主要細(xì)菌，其黏附數(shù)量的增加是提高粗飼料營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的重要原因。玉米秸稈表面黏附微生物的數(shù)量與種類隨時(shí)間的變化規(guī)律是其黏附、增殖、競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)與空間的綜合表現(xiàn)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃總細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌、厭氧真菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲桿菌及嗜淀粉瘤胃桿菌在玉米秸稈表面黏附數(shù)量都隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在24 h時(shí)黏附細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高。吳小燕等[21]以安裝永久瘤胃瘺管的宣漢黃牛為試驗(yàn)動(dòng)物，研究瘤胃微生物對(duì)不同類型底物的黏附規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物在不同原料表面的黏附數(shù)量與黏附速度差異較大。這可能與不同底物表面的黏附位點(diǎn)類型、數(shù)量以及降解速度不同有關(guān)。研究表明，在相同粉碎粒度下，不同種秸稈或牧草其比表面積存在顯著差異[22-23]，說明其供微生物黏附的位點(diǎn)數(shù)量也存在差異。瘤胃細(xì)菌的多樣性和豐度是影響瘤胃功能的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，比表面積和發(fā)酵時(shí)間對(duì)普雷沃氏菌屬、解琥珀酸弧菌屬、密螺旋體屬、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬相對(duì)豐度存在相互作用。增加底物比表面積實(shí)質(zhì)是增加微生物黏附位點(diǎn)和降解位點(diǎn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同比表面積玉米秸稈的降解速度、功能微生物在其表面的黏附時(shí)間和增殖速度不同[1]，故不同微生物的相對(duì)豐度不同。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters mean significant difference (P<0.05)。

圖5 玉米秸稈不同比表面積底物表面細(xì)菌菌群主坐標(biāo)分析

圖6 不同比表面積秸稈表面屬水平微生物主成分分析

4 結(jié) 論

提高玉米秸稈比表面積不影響玉米秸稈表面黏附細(xì)菌的種類和總細(xì)菌數(shù)量，但會(huì)增加白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲桿菌、反芻獸新月單胞菌、嗜淀粉瘤胃桿菌等瘤胃功能微生物的黏附數(shù)量，改變普雷沃氏菌屬、解琥珀酸弧菌屬、密螺旋體屬、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬、纖維桿菌屬、瘤胃桿菌屬的相對(duì)豐度，改善DM、NDF和CP的瘤胃降解率。

表5 玉米秸稈比表面積對(duì)屬水平微生物相對(duì)豐度的影響