核黃素對(duì)綿羊瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)、酶活性和菌群數(shù)量的影響

任 娜 郝小燕 張暄梓 董瑩蕊 王興崗 張建新

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

核黃素(riboflavin，RF)是反芻動(dòng)物本身和瘤胃微生物所需的必需營(yíng)養(yǎng)因子，以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式參與生物體能量、碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)，并參與葉酸、鈷銨素和吡哆醇的活化與代謝[1-2]。早期體外研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃液中添加RF提高了纖維物質(zhì)的降解率，增加了黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和總原蟲數(shù)量[3-4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在精粗比為50∶50的飼糧中添加RF改善了公牛平均日增重和飼料效率，提高了養(yǎng)分表觀消化率，增加了瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度以及總細(xì)菌、總真菌和總原蟲數(shù)量[5]。目前已有研究表明，由飼糧提供的和瘤胃微生物合成的RF不能滿足公牛瘤胃微生物生長(zhǎng)的需求[5]。目前，外源添加RF對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵和微生物生長(zhǎng)調(diào)控的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用體外發(fā)酵產(chǎn)氣法，研究不同添加水平RF對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)、酶活性和菌群數(shù)量的影響，以期明確外源補(bǔ)充RF對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵的調(diào)控機(jī)制，旨在為RF應(yīng)用于肉羊生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RF購(gòu)于北京某生物科技有限公司，純度>98%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理

瘤胃液供體動(dòng)物選用3只3周歲、體重(50.0±1.5) kg且安裝有瘤胃瘺管的杜泊×小尾寒羊雜交F1代公綿羊?；A(chǔ)飼糧依據(jù)NRC(2007)[6]配制，精粗比50∶50，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)羊自由采食和飲水，每天飼喂2次(07:00、19:00)。預(yù)試期為10 d。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)中RF在奶公牛飼糧中適宜添加水平(53 mg/kg)[5]，本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)添加水平。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對(duì)照)、15、30、45、60和75 mg/kg RF作為發(fā)酵底物，每組6個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置6個(gè)空白。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 體外發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)依據(jù)Menke等[7]體外產(chǎn)氣技術(shù)并結(jié)合尼龍袋技術(shù)進(jìn)行。試驗(yàn)羊飼喂基礎(chǔ)飼糧第11天晨飼前，通過(guò)瘺管從瘤胃的不同部位采集3只羊的瘤胃液，4層紗布迅速過(guò)濾后以1∶2的比例與人工唾液混合，保持39 ℃恒溫、旋渦狀態(tài)，并持續(xù)通入CO2。發(fā)酵底物經(jīng)烘干粉碎至粒徑為1.0 mm，準(zhǔn)確稱取0.200 0 g裝入4.0 cm×1.5 cm尼龍袋中(孔徑38～40 μm)，放入發(fā)酵管(100 mL，Haberle公司，德國(guó))，同時(shí)準(zhǔn)備6個(gè)空白(發(fā)酵管中加空尼龍袋)。發(fā)酵管39 ℃預(yù)熱后加入30 mL培養(yǎng)液，排盡氣體，記錄初始值后置于39 ℃人工瘤胃培養(yǎng)箱(DHP-9162，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中振蕩培養(yǎng)。體外發(fā)酵試驗(yàn)重復(fù)2批。

1.5 樣品采集與分析

1.5.1 產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量

記錄各發(fā)酵管0、2、4、6、8、12、16、20、24、30、36和48 h的產(chǎn)氣量，采集發(fā)酵氣體，用氣相色譜儀(Agilent 7890B，美國(guó))測(cè)定發(fā)酵48 h內(nèi)產(chǎn)生氣體中的甲烷(CH4)產(chǎn)量[8]。

1.5.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

采集發(fā)酵48 h的發(fā)酵液樣品，立即用pH計(jì)(PHS-3C，上海雷軍科技有限公司)測(cè)定pH；采用氣相色譜儀并參考Wang等[9]的方法測(cè)定發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度；參照白齊昌等[10]的方法測(cè)定發(fā)酵液氨態(tài)氮(NH3-N)濃度；采用考馬斯亮藍(lán)指示劑法測(cè)定發(fā)酵液微生物蛋白質(zhì)(MCP)濃度[10]。

1.5.3 瘤胃酶活性

按照Agarwal等[11]的方法測(cè)定發(fā)酵液羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶、果膠酶、α-淀粉酶和蛋白酶活性。酶活性單位定義為39 ℃條件下30 min內(nèi)每毫升瘤胃液釋放的還原糖量[12]。

1.5.4 瘤胃菌群數(shù)量

應(yīng)用珠磨-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取發(fā)酵液微生物總DNA，使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，并用TE buffer將DNA濃度稀釋至100 ng/mL。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定瘤胃菌群數(shù)量，將通過(guò)文獻(xiàn)查找并設(shè)計(jì)好的瘤胃10種菌群的引物對(duì)樣本菌群16S/18S rDNA的目的片段進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。瘤胃菌群基因引物序列如表2所示，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[12]。

表2 瘤胃菌群基因引物序列

1.5.5 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)結(jié)果計(jì)算

產(chǎn)氣量計(jì)算公式如下：

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)累計(jì)凈產(chǎn)氣量(mL)=某時(shí)間段產(chǎn)氣量-對(duì)應(yīng)時(shí)間段空白管產(chǎn)氣量。

采用?rskov等[13]提出的動(dòng)態(tài)發(fā)酵模型計(jì)算產(chǎn)氣參數(shù)，計(jì)算公式如下：

GP=a+b(1-e-ct)。

式中：GP為t時(shí)間點(diǎn)累計(jì)產(chǎn)氣量(mL)；a、b分別為快速和慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(mL)；c為產(chǎn)氣速率(%/h)；a+b為潛在產(chǎn)氣量(mL)。a、b、c值根據(jù)非線性最小二乘法求得。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RF對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)和甲烷產(chǎn)量的影響

由表3可知，48 h累積產(chǎn)氣量、慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量隨著RF添加水平的增加呈二次項(xiàng)升高(P<0.05)。48 h累積產(chǎn)氣量、慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量均以30 mg/kg RF組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；對(duì)照組、15、45和60 mg/kg RF組次之，顯著高于75 mg/kg RF組(P<0.05)；75 mg/kg RF組最低，顯著低于其他各組(P<0.05)。各組之間快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和甲烷產(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)。

表3 RF對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)和甲烷產(chǎn)量的影響

2.2 RF對(duì)體外發(fā)酵瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，pH隨著RF添加水平的增加呈二次項(xiàng)降低(P<0.05)，對(duì)照組pH顯著高于其他各組(P<0.05)。TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸濃度隨著RF添加水平的增加呈二次項(xiàng)升高(P<0.05)；30和45 mg/kg RF組TVFA濃度顯著高于對(duì)照組和75 mg/kg RF組(P<0.05)，15 mg/kg RF組TVFA濃度顯著高于75 mg/kg RF組(P<0.05)；75 mg/kg RF組乙酸濃度顯著低于其他各組(P<0.05)；30和45 mg/kg RF組丙酸和異戊酸濃度顯著高于對(duì)照組和75 mg/kg RF組(P<0.05)；對(duì)照組丁酸濃度顯著低于15、30、45和60 mg/kg RF組(P<0.05)；30和45 mg/kg RF組戊酸濃度顯著高于對(duì)照組和75 mg/kg RF組(P<0.05)，15和60 mg/kg RF組戊酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。乙酸/丙酸隨著RF添加水平的增加呈線性降低(P<0.05)，60和75 mg/kg RF組乙酸/丙酸顯著低于對(duì)照組以及15、30和45 mg/kg RF組(P<0.05)。氨態(tài)氮濃度隨著RF添加水平的增加呈線性升高(P<0.05)，45、60和75 mg/kg RF組氨態(tài)氮濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組之間異丁酸和MCP濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 RF對(duì)體外發(fā)酵瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

續(xù)表4項(xiàng)目ItemsRF添加水平 RF supplemental level/(mg/kg)0(對(duì)照 Control)1530456075SEMP值 P-value處理Treatment線性Linear二次Quadratic戊酸Valerate/(mmol/L)1.11c1.17ab1.23a1.21a1.19ab1.13bc0.0340.0200.6640.001異丁酸Isobutyrate/(mmol/L)1.321.391.521.521.441.360.0770.0830.7980.671異戊酸Isovalerate/(mmol/L)2.51b2.66ab2.80a2.77a2.68ab2.54b0.0890.0220.5510.001乙酸/丙酸Acetate/propionate2.67a2.61a2.64a2.62a2.58b2.55b0.0380.0490.0030.411氨態(tài)氮NH3-N/(mg/dL)8.29b8.41ab8.62ab8.85a8.89a8.89a0.2190.0460.0010.133微生物蛋白質(zhì)MCP/(mg/dL)2.192.332.342.312.292.320.1840.9720.6190.757

2.3 RF對(duì)體外發(fā)酵瘤胃酶活性的影響

由表5可知，各組之間羧甲基纖維素酶、果膠酶和纖維二糖酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。木聚糖酶活性隨著RF添加水平的增加呈線性降低(P<0.05)，75 mg/kg RF組木聚糖酶活性顯著低于對(duì)照組以及15、30和45 mg/kg RF組(P<0.05)。α-淀粉酶和蛋白酶活性隨著RF添加水平的增加呈二次項(xiàng)升高(P<0.05)；30 mg/kg RF組α-淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組以及60和75 mg/kg RF組(P<0.05)，與15和45 mg/kg RF組差異不顯著(P>0.05)，且15、45、60和75 mg/kg RF組α-淀粉酶活性高于對(duì)照組(P<0.05)；45 mg/kg RF組蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組以及15、60和75 mg/kg RF組(P<0.05)，與30 mg/kg RF組差異不顯著(P>0.05)。

表5 RF對(duì)體外發(fā)酵瘤胃酶活性的影響

2.4 RF對(duì)體外發(fā)酵瘤胃菌群數(shù)量的影響

由表6可知，總細(xì)菌、總真菌、總原蟲、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌和嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量均隨著RF添加水平的增加呈二次項(xiàng)升高(P<0.05)。30 mg/kg RF組總細(xì)菌、總真菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組以及60和75 mg/kg RF組(P<0.05)，與15和45 mg/kg RF組差異不顯著(P>0.05)；30 mg/kg RF組白色瘤胃球菌、棲瘤胃普雷沃氏菌和總原蟲數(shù)量顯著高于對(duì)照組以及15、60和75 mg/kg RF組(P<0.05)，與45 mg/kg RF組差異不顯著(P>0.05)；30 mg/kg RF組溶纖維丁酸弧菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組和75 mg/kg RF組(P<0.05)，與15、45和60 mg/kg RF組差異不顯著(P>0.05)；30和45 mg/kg RF組嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組以及15、60和75 mg/kg RF組(P<0.05)。各組之間總產(chǎn)甲烷菌數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 RF對(duì)體外發(fā)酵瘤胃菌群數(shù)量的影響

3 討 論

產(chǎn)氣量能反映瘤胃微生物對(duì)底物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵程度[14]，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率呈正相關(guān)[7]。發(fā)酵48 h累積產(chǎn)氣量、慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量的提高與TVFA濃度提高的結(jié)果相一致，歸因于總細(xì)菌、總真菌和總原蟲數(shù)量的提高，表明補(bǔ)充RF可以促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng)，從而進(jìn)一步提高飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的降解。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，公牛飼糧中添加RF提高了干物質(zhì)和有機(jī)物瘤胃降解率。甲烷生成量主要受飼糧組成、瘤胃發(fā)酵類型和微生物區(qū)系等因素的影響[15]。本試驗(yàn)中，添加RF對(duì)產(chǎn)總產(chǎn)甲烷菌數(shù)量無(wú)顯著影響，這應(yīng)該是造成甲烷產(chǎn)量無(wú)顯著變化的原因。但是，添加RF后，甲烷產(chǎn)量和總產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的變化結(jié)果與瘤胃總原蟲數(shù)量增加的結(jié)果不一致。瘤胃原蟲能為甲烷菌的生長(zhǎng)提供棲息場(chǎng)所，且原蟲發(fā)酵碳水化合物過(guò)程中產(chǎn)生的氫是甲烷菌產(chǎn)生甲烷的底物，甲烷作為甲烷菌的能源物質(zhì)，能促進(jìn)甲烷菌的生長(zhǎng)[16]。本試驗(yàn)中，添加RF提高了丙酸產(chǎn)量，碳水化合物發(fā)酵生成丙酸的過(guò)程消耗氫[16]，因此總原蟲數(shù)量的增加沒(méi)有提高甲烷產(chǎn)量。另外，RF對(duì)瘤胃內(nèi)氧化還原反應(yīng)有調(diào)控作用，RF以FAD和FMA的形式參與氫的傳遞和電子的轉(zhuǎn)移[1]。

瘤胃pH與TVFA濃度呈負(fù)相關(guān)，是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，pH小于6.2將抑制纖維的降解和微生物的代謝[17]。添加RF降低了瘤胃液pH，歸因于添加RF后TVFA濃度的提高，但pH在6.45～6.48，對(duì)瘤胃菌群的生長(zhǎng)發(fā)育和飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。瘤胃TVFA濃度的增加與總細(xì)菌、總真菌和總原蟲數(shù)量增加促進(jìn)瘤胃發(fā)酵有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，瘤胃微生物所需的RF需要外源補(bǔ)充，與Wu等[5]的試驗(yàn)結(jié)果相一致。在瘤胃微生物氧化還原反應(yīng)代謝過(guò)程中，F(xiàn)AD將碳水化合物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氫離子傳遞給NAD，生成NADH[18]。前人研究發(fā)現(xiàn)，白色瘤胃球菌的生長(zhǎng)和纖維的降解需要外源補(bǔ)充RF，且添加RF可以促進(jìn)瘤胃原蟲的生長(zhǎng)[3-4]。瘤胃中的乙酸和丙酸分別來(lái)源于微生物對(duì)飼料中纖維物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物的降解[19]。添加RF提高了瘤胃乙酸濃度，與總真菌、總原蟲及主要纖維分解菌(黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌)數(shù)量提高的結(jié)果相一致，表明RF促進(jìn)了飼糧中纖維物質(zhì)在瘤胃的降解。Wu等[5]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，公牛飼糧中添加RF提高了中性洗滌纖維瘤胃降解率。纖維分解細(xì)菌、厭氧真菌和原蟲通過(guò)分泌外纖維分解酶將飼料中的纖維物質(zhì)降解為乙酸，其中真菌產(chǎn)生的纖維酶活性最高，菌絲能穿透植物的細(xì)胞壁；而原蟲數(shù)量最多，大概占到微生物總量的50%，能夠降解約33%的纖維[20-21]。添加RF提高了瘤胃丙酸濃度，歸因于嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量的增加以及α-淀粉酶活性的升高。這3種菌是瘤胃中主要的淀粉分解菌，通過(guò)分泌α-淀粉酶將飼糧中淀粉降解為丙酸[20-21]。添加RF高了瘤胃乙酸和丙酸濃度，但是降低了乙酸/丙酸，表明瘤胃發(fā)酵類型轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生了更多的丙酸。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，添加RF后公牛瘤胃發(fā)酵類型向乙酸發(fā)酵型轉(zhuǎn)變。試驗(yàn)結(jié)果的不同可能與試驗(yàn)方法(體外和體內(nèi))的不同有關(guān)，因?yàn)轶w內(nèi)試驗(yàn)存在瘤胃壁對(duì)VFA的吸收，而且瘤胃壁對(duì)丙酸的吸收速率大于乙酸[16]。瘤胃中戊酸、異丁酸和異戊酸主要由支鏈氨基酸在瘤胃中被微生物降解產(chǎn)生，同時(shí)也是大多數(shù)纖維分解菌生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)因子[12]。添加RF后，戊酸和異戊酸濃度的增加與蛋白酶活性升高和主要蛋白分解菌(溶纖維丁酸弧菌、棲瘤胃普雷沃氏菌和嗜淀粉鏈球菌)數(shù)量的增加有關(guān)，同時(shí)也是纖維分解菌數(shù)量增加的原因之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加異戊酸提高了肉牛瘤胃纖維分解菌數(shù)量[22]。

瘤胃氨態(tài)氮是飼糧中蛋白質(zhì)的降解情況與MCP合成情況的綜合反映，氨態(tài)氮是合成MCP的重要原料[16]。本試驗(yàn)中，氨態(tài)氮濃度隨著RF添加水平的增加而增加，但各組之間MCP濃度沒(méi)有顯著差異，一定程度說(shuō)明了添加RF提高了飼糧中蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的消化率，這與發(fā)酵液中蛋白酶活性的增加同時(shí)蛋白質(zhì)分解菌數(shù)量的增加一致，表明添加RF可促進(jìn)瘤胃某些蛋白質(zhì)分解菌的生長(zhǎng)，提高蛋白質(zhì)分解酶活性。另外，氨態(tài)氮濃度的提高與原蟲數(shù)量的增加有關(guān)，原蟲吞噬細(xì)菌獲得氮源的過(guò)程中，將細(xì)菌蛋白質(zhì)降解為氨，并釋放到瘤胃液中[16]。一定程度上可防止細(xì)菌過(guò)快發(fā)酵碳水化合物生成乳酸以及pH的大幅降低；同時(shí)原蟲的脫氨基作用可釋放大量氨產(chǎn)生降解氮，供其他微生物利用合成MCP[23]。此外，本試驗(yàn)中，75 mg/kg RF組48 h累積產(chǎn)氣量以及TVFA、乙酸濃度等顯著降低，說(shuō)明RF超過(guò)一定添加水平時(shí)會(huì)對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響，其原因可能是由于RF的細(xì)菌合成和降解之間存在平衡，過(guò)多的RF不能被利用，被瘤胃細(xì)菌降解產(chǎn)生羥乙基黃素(HEF)和甲酰甲基黃素(FMF)等代謝物[24]，這些代謝物可能對(duì)瘤胃菌群及酶活性產(chǎn)生一定的抑制作用，但其具體作用及影響機(jī)制還有待研究。

4 結(jié) 論

添加RF可以促進(jìn)綿羊體外發(fā)酵，提高48 h產(chǎn)氣量及TVFA、乙酸和丙酸濃度，增加總細(xì)菌、總真菌和總原蟲數(shù)量。在本試驗(yàn)條件下，RF添加水平為30 mg/kg時(shí)體外發(fā)酵效果較好。